Projetando microfluídicos para Estudar respostas celulares Sob único ou coexistindo Chemical / Elétrica / tensão de cisalhamento Estímulos
Summary
Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.
Abstract
microcanais são capazes de criar um micro-ambiente celular preciso e controlável do pH, temperatura, concentração de sal, e outros estímulos físicos ou químicos. Eles têm sido comumente utilizado para estudos in vitro de células, fornecendo in vivo como arredores. Especialmente, como as células resposta a gradientes químicos, campos elétricos e tensões de cisalhamento tem atraído muitos interesses uma vez que estes fenómenos são importantes para compreender as propriedades e funções celulares. Estes chips de microfluidos pode ser feita de substratos de vidro, pastilhas de silício, polímeros de polidimetilsiloxano (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA), substratos ou substratos de tereftalato de polietileno (PET). Fora destes materiais, substratos de PMMA são baratos e podem ser facilmente tratados com ablação a laser e escrita. Embora alguns dispositivos microfluídicos foram projetados e fabricados para gerar múltiplos, coexistindo estímulos químicos e elétricos, nenhum deles foi consideradosuficientemente eficaz na redução repetições experimentais, em particular para fins de triagem. Neste relatório, nós descrevemos nosso projeto e fabricação de dois chips microfluídicos à base de PMMA para investigar respostas celulares, na produção de espécies reativas de oxigênio e a migração, sob / elétricos estímulos de estresse / cisalhamento químicas únicas ou coexistentes. O primeiro chip gera cinco concentrações relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, 1 e nas regiões de cultura, juntamente com um gradiente de tensão de corte produzida dentro de cada uma destas áreas. O segundo chip gera as mesmas concentrações relativas, mas com cinco diferentes intensidades de campo elétrico criado dentro de cada área de cultura. Estes dispositivos não só proporcionar células com um, controlável micro-ambiente precisa, mas também aumentar grandemente a taxa de transferência experimental.
Introduction
Em células in vivo estão rodeados por uma variedade de biomoléculas, incluindo matriz extracelular (ECM), hidratos de carbono, lípidos, e outras células. Eles funcionalizar por responder a estímulos micro-ambientais, tais como as interacções com o ECM e as respostas aos gradientes químicos de vários factores de crescimento. Tradicionalmente, os estudos in vitro de células são realizadas em pratos de cultura de células, onde o consumo de células e reagentes é grande e as células crescem num estática (não-circulantes) ambiente. Recentemente, os dispositivos micro fabricado com componentes integrados fluídicos forneceram uma plataforma alternativa para estudos de células de uma forma mais controlável. Tais dispositivos são capazes de criar um micro-ambiente precisa de estímulos químicos e físicos, enquanto minimizando o consumo de reagentes e células. Estes chips de microfluidos pode ser feita de substratos de vidro, pastilhas de silicone, polímeros de polidimetilsiloxano (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA) substratos, ou polyethylenetereftalato (PET) substratos 1-3. dispositivos baseados no PDMS é transparente, biocompatível, e permeável aos gases, tornando-os adequados para a cultura de células a longo prazo e estudos. substratos de PMMA e PET são baratos e fáceis de ser processados usando ablação a laser e escrita.
microcanais deve fornecer células com um micro-meio ambiente estável e controlável quando as células são sujeitas a diferentes estímulos químicos e físicos. Por exemplo, chips de microfluidos são usados para estudar a quimiotaxia de células. Em vez de métodos tradicionais que empregam câmara de Boyden e capilar 4,5 esses dispositivos fluídicos miniaturizados pode gerar gradientes químicos precisos para estudar comportamentos das células 1,6,7. Outro exemplo é o de estudar a migração direcional das células sob a campos elétricos (EFS), fenômeno chamado electrotaxis. Foram relatados comportamentos Electrotactic de células para ser relacionada com a regeneração do nervo 8, 9, o desenvolvimento embrionário,e cicatrização de feridas 10,11. E muitos estudos foram realizados para investigar a electrotaxis de vários tipos de células, incluindo células cancerosas 12,13, 14,15 linfócitos, células de leucemia 11, 16 e as células-tronco. Convencionalmente, placas de Petri e óculos de cobertura são usados para construir câmaras electrotactic para gerar FE 17. Tais configurações simples levantam problemas de evaporação média e FE imprecisos, mas eles podem ser superados por meio de dispositivos microfluídicos de canais fluídicos fechado, bem definidas 12,18,19.
Para estudar sistematicamente respostas celulares sob estímulos químicos e eléctricos precisas, controláveis, seria de grande utilidade para desenvolver dispositivos de microfluidos, capazes de produzir células com vários estímulos, ao mesmo tempo. Por exemplo, Li et al. relatado um dispositivo microfluídico baseado no PDMS para a criação de simples ou coexistindo gradientes químicos e EFS 20. Kao et al. devfugiu um chip microfluídico semelhante para modular a quimiotaxia de células de câncer de pulmão pelo EFS 6. Além disso, para aumentar o rendimento, Hou et al. projetou e fabricou um chip multicanal-dual-campo elétrico à base de PMMA para fornecer células com 8 diferentes estímulos combinados, (concentrações 2 pontos fortes EF x 4 químicos) sendo 21. Para aumentar ainda mais a todo e adicione o estímulo tensão de cisalhamento, foram desenvolvidos dois dispositivos microfluídicos à base de PMMA para estudar as respostas celulares em / elétricos estímulos de estresse / cisalhamento químicos simples ou coexistindo.
Relatado por Lo et al. 22,23, estes dispositivos contêm cinco canais de cultura de células independentes sujeitos a contínuo fluxo de fluidos, imitando o sistema circulatório in vivo. No primeiro chip (chip-química tensão de corte ou o chip CSS), cinco concentrações relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, e 1 são gerados nas regiões de cultura, e um gradiente de tensão de corte é produced dentro de cada uma das cinco áreas de cultura. No segundo chip (chip químico-elétrico campo ou o chip CEF), usando um único conjunto de eletrodos e 2 bombas de seringa, cinco pontos fortes EF são gerados além de cinco concentrações químicas diferentes dentro dessas áreas de cultura. Cálculos numéricos e simulações são realizadas para uma melhor concepção e operar estes chips, e células cancerosas de pulmão cultivadas dentro destes dispositivos são sujeitos a estímulos simples ou coexistentes de observação das suas respostas com respeito à produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), a taxa de migração, e a direcção da migração. Esses chips são demonstrado ser, de alto rendimento e dispositivos confiáveis para investigar como as células respondem a vários estímulos micro-ambientais de poupança de tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
fritas à base de PMMA são fabricadas usando ablação a laser e escrita que são métodos mais baratos e mais fáceis quando comparado aos chips baseados em PDMS que exigem litografia macia mais complicado. Após a criação de um chip microfluídico, a fabricação e montagem pode ser feito dentro de apenas 5 min. Existem alguns passos importantes que se deve prestar atenção para na realização do experimento. O primeiro é a questão "montagem". As placas deverão ser adequadamente coladas à camada mai…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10-cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImgeJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
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