Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.
מכשירי microfluidic מסוגלים ליצור א-סביבת מייקרו הסלולר מדויקת לשליטה של pH, טמפרטורה, ריכוז מלח, וגירויים פיסיים או כימיים אחרים. הם שימשו בדרך כלל ללימודי תאים במבחנה על ידי מתן in vivo כמו הסביבה. במיוחד, כיצד תאים בתגובה הדרגתית כימי, שדות חשמליים, מדגיש גזירת משך אינטרסים רבים מאז התופעות האלה חשובות להבנת תכונות ופונקציות הסלולר. שבבי microfluidic אלה יכולים להיות עשויים זכוכית מצעים, פרוסות סיליקון, polydimethylsiloxane (PDMS) פולימרים, polymethylmethacrylate (PMMA) מצעים, או פוליאתילן טרפתאלט מצעים (PET). מתוך החומרים הללו, מצעים PMMA הם זולים ניתן לעבד בקלות באמצעות אבלציה לייזר וכתיבה. למרות כמה מכשירים microfluidic עוצבו מפוברק להפקה מרובה, המתקיימות זו בצד זו כימית גירויים חשמליים, אף אחד מהם לא נחשביעיל מספיק בהפחתת חזרות ניסוי, בפרט למטרות הקרנה. בדו"ח זה, אנו מתארים תכנון הייצור שלנו של שני שבבים microfluidic מבוסס PMMA לחקירת תגובות הסלולר, בייצור של מיני חמצן תגובתי ואת הגירה, תחת גירויי מתח יחידים או להתאבדות כימית / חשמל / גזירה. השבב הראשון מייצר חמישה ריכוזים יחסיים של 0, 1/8, 1/2, 7/8 ו -1 באזורי התרבות, יחד עם שיפוע לחץ גזירה מיוצר בתוך כל אחד מהתחומים האלה. השבב השני מייצר אותו הריכוזים יחסיים, אך עם חמש עוצמות שדה חשמלי שונות שנוצרו בתוך כל אזור תרבות. התקנים אלה לא מספקים תאים רק עם תפוקה מדויק, מיקרו-סביבה לשליטה אלא גם להגדיל את ניסיוני מאוד.
בתאי vivo מוקפים במגוון ביומולקולות כולל תאי מטריקס (ECM), פחמימות, שומנים, ותאים אחרים. הם functionalize ידי להגיב לגירויים מיקרו-סביבתיים כגון אינטראקציות עם ECM ותגובות הדרגתיים הכימי של גורמי גדילה שונים. באופן מסורתי, מחקרים תא במבחנה נערכים במנות התא בתרבות שבה הצריכה של תאים ריאגנטים גדול ותאי לגדול סטטי (לא מחזורי) בסביבה. לאחרונה, מכשירים מפוברקי מייקרו משולב עם רכיבים נוזליים ספקו פלטפורמה חלופית מחקרי תא בצורה לשליטה יותר. מכשירים כאלה מסוגלים ליצור מייקרו-סביבה מדויקת של גירויים כימיים ופיסיים תוך מזעור צריכת תאים ריאגנטים. שבבי microfluidic אלה יכולים להיות עשויים זכוכית מצעים, פרוסות סיליקון, polydimethylsiloxane (PDMS) פולימרים, polymethylmethacrylate מצעים (PMMA), או polyethylenetereפתלטים (PET) מצעים 1-3. מכשירים מבוססי PDMS הם שקופים, ביולוגית, ו חדיר לגזים, מה שהופך אותם מתאימים תרבות מחקרים תא לטווח ארוך. מצעים PMMA ו PET הם זולים וקלים להיות מעובד באמצעות אבלציה לייזר וכתיבה.
מכשירי microfluidic אמורים לספק תאים עם סביבת מייקרו יציבה לשליטה שבו תאים כפופים כימי שונה וגירויים פיסיים. לדוגמה, שבבי microfluidic משמשים ללמוד chemotaxis של התאים. במקום שיטות מסורתיות המעסיקות בוידן קאמרית נימי 4,5 התקני fluidic מיניאטורי אלה יכולים ליצור הדרגתיים כימיים מדויקים ללימוד 1,6,7 ההתנהגויות של התאים. דוגמא נוספת היא ללמוד הגירה כיוונית של התאים תחת שדות חשמליים (EFS) חברת electrotaxis בשם תופעה. התנהגויות Electrotactic של תאים דווחו להיות קשורות עצב התחדשות 8, התפתחות עוברית 9,ו ריפוי פצעים 10,11. מחקרים רבים בוצעו כדי לחקור את electrotaxis של סוגי תאים שונים, כולל תאים סרטניים 12,13, לימפוציטים 14,15, תאי לוקמיה 11, ותאי גזע 16. כמקובל, צלחות פטרי וכוסות כיסוי המשמשים לבניית תאי electrotactic להפקת מקדמי הפליטה 17. Setups פשוט כזה מציב בעיות של אידוי בינוני וב- EFS המדויקת, אבל אפשר להתגבר עליהם על ידי מכשירי microfluidic של סגורה, ערוצי fluidic מוגדרים היטב 12,18,19.
כדי ללמוד תגובות הסלולר באופן שיטתי תחת גירויים כימיים וחשמליים מדויקים, לשליטה, זה יהיה תועלת רבה לפתח מכשירי microfluidic מסוגלים לספק תאים עם גירויים מרובים בו זמנית. לדוגמה, Li et al. דיווחתי על מכשיר microfluidic מבוסס PDMS ליצירת יחיד או להתאבדות הדרגתית כימי וב- EFS 20. קאו et al. devברח שבב microfluidic דומה לווסת את chemotaxis של תאי סרטן הריאות על ידי מקדמי פליטה 6. יתר על כן, להגדיל את התפוקה, ואח הואו. מעוצב מפוברק שבב PMMA מבוסס רב-כפול-חשמל-שדה לספק תאים עם 8 גירויים משולבים שונים, להיות (2 עוצמות EF x 4 ריכוזים כימיים) 21. כדי להגביר עוד יותר את לאורך ולהוסיף גירוי מאמץ הגזירה, פתחנו שני מכשירים microfluidic מבוסס PMMA ללימוד תגובות הסלולר תחת גירויי מתח יחיד או להתאבדות כימית / חשמל / גזירה.
דווח ע"י Lo et al. 22,23, מכשירים אלה מכילים חמישה ערוצי תרבית תאים עצמאיים בכפוף זורם fluidic רציף, מחקו את מערכת דם in vivo. בשנת השבב הראשון (שבב לחץ הכימי-גזירה או שבב CSS), חמישה ריכוזים יחסיים של 0, 1/8, 1/2, 7/8 ו -1 נוצרים באזורי התרבות, ואת שיפוע לחץ גזירה הוא produCED בתוך כל אחד מחמשת תחומי התרבות. השבב השני (השבב בתחום הכימי-חשמלי או שבב CEF), באמצעות סט אחד של אלקטרודות ו -2 משאבות מזרק, חמש עוצמות EF נוצרות בנוסף לחמישה ריכוזים כימיים שונים בתוך אזורי התרבות אלה. חישובים וסימולציות נומריות מבוצעים לעיצוב טוב יותר ולהפעיל את השבבים הללו, ותאי סרטן הריאות בתרבית בתוך מכשירים אלה כפופים גירויים יחידים או coexisting לצפיית תגובותיהם ביחס לייצור (reactive oxygen species ROS), שיעור ההגירה, ואת כיוון הגירה. שבבים אלה הם הפגינו להיות חוסכים זמן, תפוקה גבוהה והתקנים אמינים עבור חוקרת כיצד תאים מגיבים לגירויים שונים מיקרו-סביבתיים.
שבביים מבוסס PMMA מיוצרים באמצעות אבלציה ליזר וכתיבה שהן זולות ושיטות קלות בהשוואה לשבבים מבוססים PDMS הדורשים ליתוגרפיה רך יותר מסובך. לאחר תכנון שבב microfluidic, הייצור וההרכבה ניתן לעשות זאת בתוך רק 5 דקות. ישנם כמה צעדים קריטיים כי יש לשים לב כדי בביצוע הניסוי. הראשון הוא ?…
The authors have nothing to disclose.
This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
10-cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
ImgeJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |