Проектирование микрожидком устройств для исследования клеточных реакций по разовым или сосуществующих Chemical / Electrical / касательное напряжение раздражители
Summary
Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.
Abstract
Микрожидком устройства способны создавать точную и контролируемую клеточный микро-среде рН, температуры, концентрации соли и других физических или химических раздражителей. Они обычно используются для исследований клеток в пробирке, обеспечивая в естественных условиях , как окружение. В частности, как клетки ответ на химические градиенты, электрических полей и напряжений сдвига привлек много интересов, так как эти явления имеют важное значение для понимания клеточных свойств и функций. Эти микрофлюидальные чипы могут быть изготовлены из стеклянных подложек, кремниевых пластин, полидиметилсилоксан (PDMS) полимеры, полиметилметакрилат (ПММА) субстратов, или полиэтилентерефталата (ПЭТ) подложках. Из этих материалов, PMMA субстраты являются дешевыми и легко могут быть обработаны с использованием лазерной абляции и записи. Хотя несколько микрофлюидальные устройства были разработаны и изготовлены для создания нескольких, сосуществующие химические и электрические стимулы, не рассматривалось ни одно из нихдостаточно эффективно в уменьшении экспериментальных повторы, особенно для целей скрининга. В этом докладе мы описываем наше проектирование и изготовление двух ПММА на основе микрожидкостных чипов для исследования клеточных реакций, в производстве активных форм кислорода и миграции, по разовым или сосуществующих химических / электрических напряжений стимулов / сдвига. Первый чип генерирует пять относительных концентраций 0, 1/8, 1/2, 7/8, и 1 в регионах культуры, вместе с градиентом напряжения сдвига, полученного в каждой из этих областей. Второй чип генерирует те же относительные концентрации, но с пятью различными электрического напряженности поля, создаваемых в каждой области культуры. Эти устройства не только обеспечивают клетки с точным, контролируемым микросреду, но и значительно повысить экспериментальную пропускную способность.
Introduction
In vivo – клетки окружены различными биомолекулами , включая внеклеточного матрикса (ЕСМ), углеводы, липиды и другие клетки. Они функционализации путем реагирования на микро-стимулы окружающей среды, такие как взаимодействие с ECM и реакции на химические градиенты различных факторов роста. Традиционно, исследования клеточных ин витро проводят в чашки для культивирования клеток , где потребление клеток и реагентов является большим и клетки растут в статическом (внеоборотные) среды. В последнее время устройства микро быстровозводимых интегрированные с жидкостных компонентов обеспечили альтернативную платформу для исследований клеток в более контролируемым образом. Такие устройства способны создавать точную микросреду химических и физических раздражителей, при сведении к минимуму потребление клеток и реагентов. Эти микрофлюидальные чипы могут быть изготовлены из стеклянных подложек, кремниевых пластин, полидиметилсилоксан (ПДМС), полимеры, полиметилметакрилат (ПММА) субстраты, или polyethylenetereфталат (ПЭТ) подложках 1-3. Устройства ПДМС основе являются прозрачными, биосовместимыми и проницаема для газов, что делает их пригодными для длительной культуры и исследований клеток. PMMA и PET подложки являются дешевым и легко обрабатывается с помощью лазерной абляции и записи.
Микрожидком устройства должны обеспечивать клетки со стабильной и контролируемой микро-среды, в которой клетки подвержены различным химическим и физическим раздражителям. Например, микрофлюидальные чипы используются для изучения хемотаксис клеток. Вместо традиционных методов , которые используют Бойден камеры и капиллярная 4,5 эти миниатюрные жидкостный устройства могут генерировать точные химические градиенты для изучения поведения клеток 1,6,7. Другим примером может служить для изучения миграции клеток направленного "под электрическими полями (EFS), явление назвали электротаксис. Сообщили Electrotactic поведение клеток , чтобы быть связано с регенерации нерва 8, 9 , эмбриональное развитие,и ранозаживляющие 10,11. И многие исследования были проведены для изучения электротаксис различных типов клеток , включая раковые клетки 12,13, лимфоциты 14,15, лейкозных клеток 11, и стволовые клетки 16. Обычно чашки Петри и покровные стекла используются для построения electrotactic камер для генерации ЭФ 17. Такие простые расстановок создают проблемы среднего испарения и неточных ЭФ, но они могут быть преодолены с помощью микрожидкостных устройств закрытых, четко определенных жидкостных каналов 12,18,19.
Для того, чтобы систематически изучать клеточные ответы в рамках точных, контролируемых химических и электрических стимулов, было бы весьма полезным для разработки микрожидкостных устройств, способных обеспечивать клетки с множественными стимулами одновременно. Например, Ли и др. сообщает микрожидком устройство PDMS основе для создания одного или сосуществующих химические градиенты и ЭФ 20. Као и др. DEVскрывшийся аналогичный микрожидкостных чип модулировать хемотаксис клеток рака легких с помощью ЭФ 6. Кроме того, чтобы увеличить пропускную способность , Hou и соавт. спроектированы и изготовлены ПММА на основе чипа многоканальная-двойного электрического поля , чтобы обеспечить клетки с 8 различными комбинированными раздражителями, будучи (2 EF сильные х 4 химических концентраций) 21. Для дальнейшего увеличения повсюду и добавить напряжение сдвига стимула, мы разработали два микрожидкостных устройств на основе ПММА для изучения клеточных реакций при одно- или сосуществующих химических / электрических напряжений стимулов / сдвига.
Сообщил Lo и др. 22,23, эти устройства содержат пять независимых каналов клеточной культуры , подлежащем непрерывному жидкостный текучий, имитируя кровеносной системы в естественных условиях. В первом чипе (химического сдвига чипа напряжения или чипа CSS), пять относительных концентраций 0, 1/8, 1/2, 7/8 и 1 формируются в областях культуры, и градиент напряжения сдвига произвоCED внутри каждой из пяти областей культуры. Во втором кристалле (химико-электрического поля микросхемы или чипа CEF), с помощью одного одного комплекта электродов и 2 шприцевые насосы, пять EF сильные генерируются в дополнение к пяти различных химических концентраций в этих областях культуры. Численные расчеты и моделирование выполняются более эффективно разрабатывать и эксплуатировать эти чипы, и рак легких клетки, культивируемые внутри этих устройств могут быть одно- или сосуществующих стимулов для наблюдения за их ответы в отношении производства активных форм кислорода (ROS), скорость миграции, и направление миграции. Эти чипы продемонстрировано, экономии времени, высокой пропускной способностью и надежные устройства для исследования, как клетки реагируют на различные микро-стимулы окружающей среды.
Protocol
Representative Results
Discussion
PMMA на основе чипов, изготовленных с использованием лазерной абляции и письма, которые дешевле и проще методы по сравнению с PDMS на основе чипов, которые требуют более сложной мягкой литографии. После разработки микрожидком чипа, изготовление и сборка может быть сделано в течение всего 5 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10-cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImgeJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
- Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- Adler, J. Chemoreceptors in bacteria. Science. 166, 1588-1597 (1969).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
- Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
- Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
- Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
- Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
- Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
- Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
- Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
- Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
- Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
- Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
- Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
- Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
- Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
