مفهوم TERROIR تفسر من خلال العنب بيري الايض وTranscriptomics
Summary
توضح هذه المقالة تطبيق الايض غير مستهدفة، transcriptomics والتحليل الإحصائي متعدد المتغيرات إلى النصوص التوت العنب والأيض من أجل التبصر في مفهوم TERROIR، أي تأثير البيئة على الصفات النوعية بيري.
Abstract
يشير TERROIR إلى مزيج من العوامل البيئية التي تؤثر على خصائص المحاصيل مثل العنب (كرمة العنب الاوروبي) وفقا لموائل معينة وممارسات الإدارة. يوضح هذا المقال كيف يمكن الكشف عن بعض التوقيعات TERROIR في metabolome التوت وTranscriptome على من كورفينا الكرمة الصنف باستخدام التحليل الإحصائي متعدد المتغيرات. تتطلب هذه الطريقة لأول مرة خطة أخذ العينات المناسبة. في دراسة الحالة هذه، وقد تم اختيار استنساخ معين من الصنف كورفينا لتقليل الاختلافات الوراثية، وجمعت عينات من سبعة الكروم يمثلون ثلاثة مختلفة-مناطق الكلى خلال ثلاثة مواسم النمو المختلفة. ينصح نهج الايض LC-MS تشتته نظرا لحساسيته العالية، يرافقه معالجة البيانات بكفاءة باستخدام برنامج MZmine واستراتيجية تحديد المستقلب على أساس تحليل شجرة تجزئة. تحليل Transcriptome على الشامل يمكن تحقيقه باستخدام ميكروأرستحتوي على تحقيقات تغطي ~ 99٪ من مجموع الجينات الكرمة توقع، والسماح للتحليل المتزامن لجميع الجينات وأعرب تفاضلي في سياق TERROIRS مختلفة. وأخيرا، وتحليل البيانات متعدد المتغيرات على أساس أساليب الإسقاط يمكن استخدامها للتغلب على تأثير قوي، خمر معين، والسماح للالايض والبيانات transcriptomics إلى أن تكون متكاملة وتحليلها في التفاصيل لتحديد الارتباطات بالمعلومات.
Introduction
تحليل البيانات على نطاق واسع على أساس الجينوم، ترنسكربيتوم، proteomes وmetabolomes النباتات يقدم نظرة غير مسبوقة في سلوك الأنظمة المعقدة، مثل الخصائص TERROIR من النبيذ التي تعكس التفاعل بين النباتات الكرمة وبيئتهم. لأن TERROIR من النبيذ يمكن أن يكون مختلفا حتى عندما تزرع استنساخ الكرمة متطابقة في كروم العنب مختلفة، تحليل الجينوم هو من فائدة تذكر لأن الجينوم نسيلي متطابقة. وبدلا من ذلك فإنه من الضروري أن ننظر إلى العلاقات المتبادلة بين التعبير الجيني وخصائص التمثيل الغذائي التوت، التي تحدد سمات نوعية النبيذ. تحليل التعبير الجيني على مستوى الفوائد Transcriptome على من الخصائص الكيميائية مماثلة من كل النصوص، مما يسهل التحليل الكمي من خلال استغلال الخصائص عالمية مثل التهجين لتحقيقات ثبتوا على المجهرية. في المقابل، الأساليب التحليلية الشاملة في البروتينات لالثانية الايض أكثر صعوبة بسبب تنوع الفيزيائية والكيميائية كبير من البروتينات الفردية والأيض. في حالة الايض هذا التنوع هو أكثر تطرفا لأن الأيض الفردية تختلف كثيرا في الحجم، والاستقطاب، وفرة والتقلب، لذلك لا عملية الاستخراج واحدة أو المنهج التحليلي يقدم نهجا شموليا.
بين منصات تحليلية مناسبة لنواتج غير متقلبة، تلك القائمة على الأداء العالي اللوني السائل بالإضافة إلى قياس الطيف الكتلي (HPLC-MS) هي أكثر حساسية بكثير من البدائل مثل HPLC مع الأشعة فوق البنفسجية أو الصمام الثنائي للكشف عن مجموعة (HPLC للأشعة فوق البنفسجية، HPLC-DAD ) أو الرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفي، ولكن التحليل الكمي من قبل HPLC-MS يمكن أن تتأثر الظواهر مثل تأثير مصفوفة وقمع أيون / تعزيز 1-3. التحقيق في مثل هذه الآثار خلال تحليل التوت العنب كورفينا بواسطة HPLC-MS استخدام مصدر تأين بالإرذاذ الإلكتروني (HPLC-Eأظهر SI-MS) أن السكريات والجزيئات الأخرى بأقل مرات الاحتفاظ تم الإبلاغ عنها بقوة، وربما يعكس أيضا عدد كبير من الجزيئات في هذه المنطقة، وذلك وفرة من الجزيئات الأخرى يمكن التقليل من شأنها، المبالغة أو تتأثر تأثير المصفوفة ولكن تطبيع البيانات للتأثير مصفوفة يبدو أن يكون لها تأثير محدود على 4،5 النتائج بشكل عام. تم تحسين طريقة وصفها هنا لتحليل الأيض المتوسطة القطبية التي تتراكم على مستويات عالية في التوت العنب أثناء النضج، والتي أثرت بشكل ملحوظ من قبل TERROIR. وتشمل الانثوسيانين، الفلافونول flavan-3-شريان الحياة، procyanidins، الفلافونويد أخرى، ريسفيراترول، stilbenes والأحماض hydroxycinnamic وحمض الهيدروكسي، التي تحدد معا اللون والطعم والخصائص المتعلقة بالصحة من النبيذ. يتم تجاهل الأيض الأخرى، مثل السكريات والأحماض العضوية الأليفاتية، لأن الكميات التي HPLC-MS لا يمكن الاعتماد عليها نظرا لمصفوفة يالحظر وقمع أيون الظواهر 5. ضمن نطاق القطبية التي اختارتها هذه الطريقة، فإن هذا النهج هو تشتته في أنها تهدف للكشف عن العديد من نواتج الأيض المختلفة ممكن 6.
وسهلت وسائل Transcriptomics التي تسمح الآلاف من سجلات الكرمة التي يتعين رصدها في وقت واحد من قبل توافر كامل الكرمة الجينوم تسلسل 7،8. وقد تطورت أساليب transcriptomics مبكرة على أساس الإنتاجية العالية كدنا] تسلسل مع ظهور الجيل المقبل من التسلسل إلى مجموعة من الإجراءات الموضحة مجتمعة تكنولوجيا الحمض النووي الريبي يليها. هذا النهج سرعان ما أصبحت الطريقة المفضلة للدراسات transcriptomics. ومع ذلك، مجموعة كبيرة من المؤلفات على أساس ميكروأري، والتي تسمح للآلاف من النصوص ليكون كميا في موازاة ذلك عن طريق التهجين، تراكمت لالكرمة. في الواقع، قبل أن يصبح RNA تسلسل وتعميم التكنولوجيا، العديد من المنصات ميكروأري التجارية مخصصة كانوضعت السماح Transcriptome على الكرمة التي يتعين تفتيشها بقدر كبير من التفصيل. من بين تشكيلة واسعة من المنصات، يسمح سوى اثنين من تحليل Transcriptome على الجينوم على نطاق 9. سمحت مجموعة معظم تطورت التهجين لمدة تصل إلى 12 عينة مستقلة على جهاز واحد، وبالتالي تقليل تكاليف كل تجربة. صفائف دون 12 لكل 135،000 تتألف تحقيقات 60 مير تمثل 29549 النصوص الكرمة. وقد استخدم هذا الجهاز في عدد كبير من الدراسات 10-24. وقد تم الآن وقف العمل بهذه الأنظمة الأساسية اثنين ولكن تم مؤخرا تصميم ميكروأري مخصص جديد ويمثل تطورا أكثر حداثة لأنه يحتوي على عدد أكبر من تحقيقات تمثل الجينات العنب المكتشفة حديثا إضافية 25.
مجموعات البيانات البيع الكبيرة التي تنتجها transcriptomics والايض تحليل تتطلب الأساليب الإحصائية المناسبة لتحليل البيانات، بما في ذلك تقنيات متعدد المتغيرات لتحديد العلاقات المتبادلة بين شكل مختلفالصورة من البيانات. تقنيات متعدد المتغيرات الأكثر استخداما هي تلك المبنية على الإسقاط، وهذه يمكن أن تكون غير خاضعة للرقابة، مثل تحليل المكون الرئيسي (PCA)، أو تشرف، مثل الإسقاط المتعامد ثنائي الاتجاه للهياكل الكامنة تحليل التمايز (O2PLS-DA) 26. بروتوكول المعروضة في هذه المقالة يستخدم PCA لتحليل البيانات استكشافية وO2PLS-DA لتحديد الفروق بين مجموعات من العينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة الايض، transcriptomics والبروتوكولات التحليل الإحصائية المستخدمة لتفسير مفهوم TERROIR العنب التوت. تحليل الايض بواسطة HPLC-ESI-MS حساسة بما يكفي للكشف عن أعداد كبيرة من المركبات في وقت واحد، ولكن يتأثر الكميات النسبية من تأثير مصفوفة وقمع أيون / تعزيز. ومع ذلك، فقد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 “An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine”. This work was supported by the ‘Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale’ project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the ‘Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)’ project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project “The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions”.
Materials
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5×2.1mm; 5μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150×2.1mm; 3μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | – | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In – One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | – | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | – | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus – 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | – | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
References
- Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
- Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go?. Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
- Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
- Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
- Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
- Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
- Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M., Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. 11, (2012).
- Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
- Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
- Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
- Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
- Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
- Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
- Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
- Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
- Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
- Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
- Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
- Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
- Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
- Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).
