포도 베리 대사 체학 및 Transcriptomics을 통해 해석 떼루아 개념
Summary
이 문서는 즉 떼루아 개념에 대한 통찰력을 얻기 위해 포도 베리 성적 증명서 및 대사에 타겟이 불분명 한 대사 체학, transcriptomics 및 다변량 통계 분석의 응용 프로그램을 설명 베리 품질 특성에 대한 환경의 영향.
Abstract
떼루아 특히 서식지 및 관리 방법에 따라 같은 포도 (유럽 종 포도)로 작물의 특성에 영향을 미치는 환경 요인의 조합을 의미합니다. 이 문서에서는 특정 떼루아 서명이 다변량 통계 분석을 사용하여 포도의 품종, 조기의 베리 대사 체 및 사체에서 검출 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 먼저 적절한 샘플링 계획이 필요합니다. 이 사례에서, 조기 품종의 특정 클론 유전 적 차이를 최소화하도록 선택되고, 샘플은 세 가지 성장 계절 동안 세 가지 매크로 영역을 나타내는 일곱 포도에서 수집 하였다. 타겟팅되지 않은 LC-MS의 대사 체학 접근 MZmine 소프트웨어 및 단편화 트리 분석을 기초 대사 식별 전략을 사용하여 효율적으로 데이터 처리를 수반 높은 민감도 때문에 권장된다. 종합 사체 분석은 마이크로 어레이를 사용하여 달성 될 수있다함유 프로브 다른 TERROIRS의 컨텍스트에서 모든 차등 유전자 발현의 동시 분석을 가능 ~ 모든 예측 리세 유전자의 99 %를 커버. 마지막으로, 투영 방법에 기초하여 다변량 데이터 분석은 대사 체학 및 transcriptomics 데이터 통합 정보의 상관 관계를 식별하기 위해 상세하게 분석 될 수 있도록 강력한 빈티지 특정 효과를 극복하기 위해 사용될 수있다.
Introduction
식물 게놈 전 사체, 프로테옴 및 metabolomes에 기초하여 대규모 데이터 분석은 포도 식물과 그 환경 사이의 상호 작용을 반영하는 와인 떼루아 특성과 같은 복잡한 시스템의 작동에 대한 새로운 통찰력을 제공한다. 동일한 포도 나무의 클론이 다른 포도원에서 재배하는 경우에도 와인의 떼루아 구별 할 수 있기 때문에 클론 게놈이 동일하기 때문에, 게놈 분석은 거의 사용이다. 대신 유전자 발현 와인의 품질 특성을 결정하는 열매의 대사 특성 간의 상관 관계를 볼 필요가있다. 마이크로 어레이에 고정 된 프로브와 같은 하이브리드와 같은 보편적 인 특성을 이용하여 정량 분석을 용이하게 모든 성적 증명서의 유사한 화학적 성질,의 사체 혜택의 수준에서 유전자 발현의 분석. 프로테오믹스 A의 대조적으로, 보편적 인 분석 방법차 대사 체학 때문에 개별 단백질 및 대사 산물의 거대한 물리적, 화학적 다양성을 더 도전입니다. 대사 체학의 경우 개별 대사 산물의 크기, 극성, 풍부하고 변동성에 크게 다르기 때문에 이러한 다양성은 훨씬 더 극단적이다, 그래서 하나의 추출 과정이나 분석 방법 론적 접근 방식을 제공합니다.
비 휘발성 대사 적합한 분석 플랫폼 중, 고성능 액체 크로마토 그래피에 기초하여 그 질량 분석계에 연결된 (HPLC-MS)는 훨씬 더 민감 자외선 또는 다이오드 배열 검출기를 가진 HPLC (HPLC-UV, HPLC-DAD 같은 대안보다 ) 또는 HPLC-MS에 의해 핵 자기 공명 (NMR) 분광법 있지만 정량 분석은 이러한 매트릭스 효과 이온 진압 / 인핸스 1-3 현상에 의해 영향을받을 수있다. (HPLC-E를 전기 분무 이온화 소스를 사용하여 HPLC-MS에 의한 조기는 포도 열매의 분석시 이러한 영향의 조사SI-MS)은 가장 낮은 체류 시간과 당 및 다른 분자 강하게 아마도이 영역에서 분자의 다수를 반영 과소 것으로 나타났다 및 다른 분자의 존재 량 매트릭스 효과에 의해 과대 또는받지 과소 평가 될 수 있다는 하지만, 매트릭스 효과에 대한 데이터 정규화는 전체 결과 4,5에 제한된 영향을 미칠 것 같았다. 본원에 기재된 방법은 숙성 중에 포도 열매에서 높은 수준으로 축적 매체 극성 대사 산물의 분석을 위해 최적화되고, 이는 상당히 떼루아의 영향. 그들은 함께 색상, 맛과 와인의 건강 관련 특성을 결정 안토시아닌, 플라 보놀, flavan-3-OLS, 프로시아니딘, 다른 플라보노이드, 레스베라트롤, 스틸 벤, 히드 록시 산, 하이드 록시 산을 포함한다. HPLC-MS에 의한 정량은 신뢰할 수 있기 때문에 같은 당 및 지방족 유기산과 같은 다른 대사는, 때문에 effec 행렬에 무시됩니다t 이온 억제 현상 (5). 이 방법에 의해 선택된 극성의 범위 내에서 접근 가능 6만큼 다른 대사 물질을 검출하는 것을 목적으로 불특정이다.
포도 나무의 성적 증명서의 수천을 동시에 모니터링 할 수 Transcriptomics 방법은 전체 포도 게놈 서열 7,8의 가용성에 의해 촉진된다. 높은 처리량의 cDNA 서열에 기초하여 조기 transcriptomics 방법 일괄 RNA-SEQ 기술로 설명한 절차의 집합으로 차세대 서열의 출현으로 발전해왔다. 이 방법은 빠르게 transcriptomics 연구에 대한 선택의 방법이되고있다. 그러나, 성적 증명서의 수천 하이브리드에 의해 병렬로 정량화 할 수 있도록 마이크로 어레이를 기반으로 문학의 큰 몸은 포도 나무에 대한 축적하고있다. RNA-서열이 주류 기술이되기 전에 실제로, 많은 전용 상용 마이크로 어레이 플랫폼은 있었다개발 허용 포도 나무의 사체는 훌륭한 세부 사항에 검사합니다. 플랫폼의 광대 한 다양한 가운데, 두 개의 게놈 전체의 전 사체 분석 (9)을 허용했다. 가장 진화 배열 따라서 각 실험의 비용을 절감하는 하나의 장치에서 최대 12 개의 독립적 인 샘플의 혼성화시켰다. 12 서브 어레이는 각각 29,549 포도 나무의 성적을 나타내는 135,000 60 머 프로브를 구성. 이 장치는 시험 10-24의 다수에 사용되고있다. 이 두 플랫폼은 이제 중단되었지만 새 사용자 정의 마이크로 어레이는 최근 설계되고있어 추가 새로 발견 된 포도 나무의 유전자 (25)를 나타내는 프로브의 더 큰 수를 포함로 최근 개발을 나타냅니다.
transcriptomics와 대사 체학 분석에 의해 생성 된 대형 판매 데이터 세트는 다른 형태 사이의 상관 관계를 결정하기 위해 다변량 기법을 포함한 데이터 분석에 적합한 통계 방법을 필요로데이터의. 가장 널리 사용되는 변수 기술들은 투영에 기초하여 해당하며, 여기에는 주성분 분석 (PCA), 또는, 자율 될 수있는 잠재적 인 구조 판별 분석 (O2PLS-DA) (26)에 양방향 정사영 같은 감독. 이 문서에 제시된 프로토콜은 샘플 그룹 간의 차이를 식별하기 위해 탐색 적 데이터 분석 및 O2PLS-DA에 대한 PCA를 사용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는 포도 베리 떼루아 개념을 해석하는 데 사용되는 대사 체학, transcriptomics 및 통계 분석 프로토콜을 설명합니다. HPLC-ESI-MS에 의해 대사 체학 분석 동시에 대사 산물을 대량을 검출하기에 충분히 민감하지만, 상대적 정량은 매트릭스 효과 이온 억제 / 강화에 의해 영향을 받는다. 그러나 유사한 접근 방식은 이미 조기는 열매의 숙성 및 수확 후 고사를 설명하는 데 사용되었으며, 매트릭…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 “An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine”. This work was supported by the ‘Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale’ project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the ‘Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)’ project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project “The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions”.
Materials
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5×2.1mm; 5μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150×2.1mm; 3μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | – | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In – One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | – | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | – | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus – 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | – | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
References
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