グレープベリーメタボロミクスとトランスクリプトを通して解釈テロワールコンセプト
Summary
この記事では、 すなわち 、テロワールの概念を洞察するために、ベリー品質形質に対する環境の影響をブドウ果実の転写産物および代謝物への非標的メタボロミクス、トランスクリプトミクスと多変量統計解析のアプリケーションについて説明します。
Abstract
テロワールは、特定の生息地や経営慣行に従って、このようなブドウ（ ブドウ ）などの作物の特性に影響を与える環境要因の組み合わせを指します。この記事では、特定のテロワールの署名が多変量統計解析を用いて、ブドウ品種のコルビナのベリーメタボロームとトランスクリプトームで検出することができる方法を示しています。この方法は、まず、適切なサンプリング計画が必要です。このケーススタディでは、コルビナ品種の特定のクローンは遺伝的差異を最小限に抑えるように選択し、試料は、3つの異なる栽培期間中に三つの異なるマクロゾーンを表す7ブドウ畑から収集しました。非標的LC-MSメタボロミクスのアプローチはMZmineソフトウェアおよびフラグメンテーションツリー分析に基づいて、代謝物同定の戦略を使用して効率的なデータ処理を伴う、その高感度のために推奨されます。包括的トランスクリプトーム解析は、マイクロアレイを用いて達成することができますすべての〜99％をカバー含むプローブは異なるテロワールのコンテキスト内のすべての示差的に発現する遺伝子の同時分析を可能にする、ブドウの遺伝子を予測しました。最後に、投影法に基づいて、多変量データ解析は、メタボロミクスとトランスクリプトミクスデータを統合し、有益な相関を同定するために詳細に分析することを可能にする、強力なヴィンテージ特有の効果を克服するために使用することができます。
Introduction
植物のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームおよびメタボロームに基づいて、大規模データ解析は、ブドウの植物とその環境との相互作用を反映したワインのテロワールの特性のような複雑なシステムの挙動に前例のない洞察を提供しています。ワインのテロワールが同一のブドウのクローンが異なるブドウ畑で栽培された場合でも明瞭な可能性があるので、クローンのゲノムが同じであるため、ゲノミクス解析はほとんど役に立ちません。その代わりに、遺伝子発現とワインの品質特性を決定ベリーの代謝特性との相関関係を調べることが必要です。マイクロアレイ上に固定化されたプローブに、そのようなハイブリダイゼーションのような普遍的な特性を利用することによって定量分析を容易にする全ての転写物の類似の化学的特性から、トランスクリプトームの利益のレベルでの遺伝子発現の解析。プロテオミクスaの対照的に、ユニバーサル分析方法NDメタボロミクスが原因個々のタンパク質および代謝産物の巨大な物理的および化学的多様性より挑戦です。メタボロミクスの場合、個々の代謝産物がサイズ、極性、豊かさとボラティリティに大幅に異なるため、この多様性はさらに極端なので、単一の抽出方法や分析方法は、全体的なアプローチを提供しています。
不揮発性代謝物のために適切な分析プラットフォームのうち、高速液体クロマトグラフィーに基づくものを質量分析に連結された（HPLC-MS）は、はるかに敏感例えば紫外線またはダイオードアレイ検出器を用いたHPLC（HPLC-UV、HPLC-DADなどの代替よりも）または核磁気共鳴（NMR）分光法が、HPLC-MSによる定量分析は、マトリックス効果とイオン抑制/強化1-3のような現象に影響され得ます。 （HPLC-Eをエレクトロスプレーイオン化源を用いてHPLC-MSによるコルビナブドウ果実の解析中にこのような効果の調査SI-MS）は、最小の保持時間を有する糖および他の分子を強くおそらくこの領域中の分子の多くを反映し、過少報告されたことを示し、他の分子の存在量は、マトリックス効果によって過大評価または影響を受けず、過小評価することができることしかし、マトリックス効果のためのデータの正規化は、全体の結果4,5への影響は限定的を持っているように見えました。本明細書に記載される方法は、熟成中ブドウ果実において高レベルで蓄積媒体極性代謝物の分析のために最適化され、そしてこれはかなりテロワールによって影響を受けます。彼らは一緒にワインの色、味と健康関連の特性を決定する、アントシアニン、フラボノール、フラバン-3-オール、プロシアニジン、他のフラボノイド、レスベラトロール、スチルベン、ヒドロキシ酸およびヒドロキシ安息香酸が含まれます。 HPLC-MSによる定量の信頼性が低いので、そのような糖や脂肪族有機酸などの他の代謝産物は、原因effec行列に無視されますトンとイオン抑制現象5。この方法により、選択された極性の範囲内に、アプローチは、可能な6限り多くの異なった代謝物を検出することを目的とするという点で非標的です。
ブドウの転写産物の数千人が同時に監視できるようにするトランスクリプトーム法は、完全なブドウのゲノム配列7,8の利用可能性によって促進されます。ハイスループットのcDNA塩基配列決定に基づいて、初期のトランスクリプトミクス手法をまとめ、RNAのSeq技術として記載された手順のコレクションに次世代シーケンサーの登場と進化してきました。このアプローチは、急速にトランスクリプトミクス研究のための最適な方法になってきています。しかし、転写産物の数千人は、ハイブリダイゼーションによって並列に定量化することを可能にするマイクロアレイに基づく文学の大きな体は、ブドウのために蓄積してきました。 RNA-seqが主流の技術になる前に実際に、多くの専用の市販のマイクロアレイプラットフォームをしていましたブドウトランスクリプトームは、非常に詳細に検査することを可能にする開発。プラットフォームの多種多様な中で、2つだけは、ゲノムワイドなトランスクリプトーム解析9を可能にしました。最も進化した配列は、このように各実験のコストを削減し、単一のデバイスに最大12の独立したサンプルのハイブリダイゼーションを可能にしました。 12サブアレイはそれぞれ29549ブドウの転写産物を表す135,000 60-merのプローブを含んでいました。この装置は、試験10-24多数のに使用されています。これら2つのプラットフォームは、現在廃止されましたが、新しいカスタムマイクロアレイは、最近設計されていて、それが追加新たに発見されたブドウの遺伝子25を表すプローブのさらに多くが含まれているとして、より多くの最近の発展を表しています。
トランスクリプトミクスとメタボロミクス解析によって生成された大販売データセットは、別のフォームとの間の相関を決定するために、多変量技術を含むデータ分析に適した統計的手法を必要とし、データの秒。最も広く使用されている多変量技術は、投影に基づくものであり、これらは、主成分分析（PCA）、又は、教師なしとすることができるような潜在構造判別分析（O2PLS-DA）26への双方向直交射影として、監督します。この記事で紹介したプロトコルは、サンプルのグループ間の差異を識別するために、探索的データ解析のためのPCAとO2PLS-DAを使用しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、メタボロミクス、トランスクリプトミクスとブドウ果実のテロワールの概念を解釈するために使用される統計解析プロトコルについて説明します。 HPLC-ESI-MSによるメタボロミクス解析を同時に代謝産物の多くを検出するのに十分な感度であるが、相対的な定量は、マトリックス効果とイオン抑制/増強に影響されます。しかし、同様のアプローチが既にコルビナ果実の熟成及び…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 “An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine”. This work was supported by the ‘Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale’ project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the ‘Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)’ project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project “The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions”.
Materials
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5×2.1mm; 5μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150×2.1mm; 3μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | – | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In – One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | – | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | – | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus – 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | – | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
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