環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発
1National Exposure Research Laboratory,U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory,U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences,University of Cincinnati
Summary
In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.
Abstract
病因および環境病原体に対するヒトの曝露の影響世界中の主要な関心事であると、このように、効果的なコストを用いて露光し、感染を評価する能力、高スループットのアプローチが不可欠であろう。この原稿は、同時に複数の病原体に対するヒトの唾液中の抗体の存在を測定することができるビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイの開発と分析を記載します。血清より収集するために、非侵襲的に安価かつ容易であるため、唾液は、この用途に特に魅力的です。環境病原体からの抗原は、カルボキシル化ミクロスフェア（ビーズ）に結合され、ビーズに基づく、溶液相アッセイを用いたヒトの唾液サンプルの非常に少量で、抗体を測定するために使用しました。ビーズはカンピロバクター、ヘリコバクター・ピロリ菌、トキソプラズマ、ノロウイルス（G I.1およびG II.4）およびA型肝炎ウイルス由来の抗原と結合させました。抗原が十分に結合させたことを確認するために、ビーズは、結合は、ビオチン化抗種二次検出抗体およびストレプトアビジンR-フィコエリトリンレポーター（SAPE）とのインキュベーション、続いて、種特異的な、動物由来の一次捕捉抗体を用いて確認しました。非特異的結合を測定するための対照として、あるビーズセットは、それが任意の抗原に結合しなかった以外、他に同様に処理しました。抗原結合およびコントロールビーズは、次いで、フローサイトメトリーの原理に基づいて、ハイスループット分析器で測定し、プロスペクティブ・採取したヒト唾液試料と共にインキュベートし、そして各抗原に対する抗体の存在は、蛍光強度中央値の単位（MFI）を測定しました。 。このマルチプレックスイムノアッセイは少ないサンプルでより多くのデータを含む多くの利点を、持っています。コスト削減と労働;関心のある多くのターゲットにアッセイをカスタマイズする機能。結果は、唾液、マルチプレックスイムノアッセイをespeciaあり得る、以前の曝露および感染を識別することが可能であることを示しています大規模な人間の集団を含むサーベイランス研究でLLY有用。
Introduction
下痢関連の病気の85八パーセントは、全世界で約150万人の死亡を引き起こし、汚染された水へのヒトの暴露、危険な食品、および不衛生/衛生状態に関連付けられている、の大半は子供1です 。これは、公衆衛生当局や政策立案者のための懸念の主な原因です。水性およびその他の環境の病原体に関連したエクスポージャーや病気を調査するための努力で、我々は、ヒト試料2-4中の抗体を測定するためのマルチプレックスイムノアッセイを開発しました。この方法は、これらの病原体へのヒトの暴露を決定するために、より良いimmunoprevalence入射感染を定義するために疫学的研究に適用することができます。
唾液は、人間のバイオマーカー研究のための血清の代替としてかなりの可能性を秘めています。唾液を使用する利点の中でも、サンプル収集、低コストの非侵襲性と使いやすさであり、試料を容易に<子供5-7から収集することができます/ SUP>。血清および唾液サンプルは、Hに対する抗体のために広く研究されてきましたピロリ 2,3,8、 熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）9、 赤痢アメーバ 10、クリプトスポリジウム 3,11、 肺炎連鎖球菌 12、肝炎ウイルスAとC 13-14、 ノロウイルス 2-4,15、T.ゴンジ 2-4、デング熱ウイルス16、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）17、および大腸菌 O157：H7 18。
マルチプレックスイムノアッセイは同時に単一のサンプルボリューム内および単一サイクルまたは実行中の複数の検体の分析を可能にします。 C.からの多重化抗原ジェジュニ 、T.ゴンジ、ピロリ菌は、A型肝炎ウイルス、および2つのノロウイルスを使用して、これらの病原体に対するヒト唾液のIgGおよびIgA 2-4 3,4および血漿のIgG 2,3抗体応答を測定するために使用されましたビーズベースの多重化イムノアッセイ。水、土壌、食品中の微生物への曝露の疫学的研究に関連して使用される場合、本研究において記載されるアッセイのタイプは、環境病原体によって引き起こされる感染症の理解を高めるために貴重な情報を提供することができます。また、このような研究から得られた唾液抗体のデータは、リスク評価モデル19-22を改善するために使用することができます。
Protocol
承認は、米国の一部として、プエルトリコ、ボケロンビーチでbeachgoersから刺激滲出唾液サンプルを収集するための治験審査委員会（IRB＃08から1844まで、ノースカロライナ大学チャペルヒル、ノースカロライナ州、米国）から入手しました環境保護庁（USEPA）国立疫学およびレクリエーション（NEEAR）水研究23の環境アセスメントは、水泳関連エクスポージャーや病気を評価しました。?…
Representative Results
一つのユニークなビーズセットは、変動をサンプリングするために、非特異的な結合とサンプルを測定するための対照として使用しました。これらのビーズは、それらがカップリング工程の任意の抗原と共にインキュベートされなかったことを除いて、抗原結合ビーズと同じように処理しました。全唾液試料とインキュベートコントロールビーズから得られた> 500 M…
Discussion
これらの結果は、マルチプレックスイムノアッセイ法は、免疫または免疫陰性である唾液サンプルとを区別するために有用であることを示しています。免疫陽性を決定するために、シングルカットオフポイントは、平均+唾液試料のすべてでテスト制御カップリングしていないビーズの対数変換MFI応答の3つの標準偏差を計算することによって開発されました。カットオフポイントは、単一ま?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.
Materials
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387 : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori : lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni : heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) | KPL | 16-10-02 | Used for Salivary Immunoassay |
| Consumables | |||
| 1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1000 µL pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
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Cite This Article
Augustine, S. A. J., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K. D., Plunkett, T. R. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).