O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais
Summary
In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.
Abstract
A etiologia e os impactos da exposição humana aos patógenos ambientais são uma grande preocupação no mundo inteiro e, assim, a capacidade de avaliar a exposição e infecções usando rentáveis, abordagens de alto rendimento seria indispensável. Este manuscrito descreve o desenvolvimento e análise de um imunoensaio baseado em multiplex-grânulo capaz de medir a presença de anticorpos na saliva humana a vários patógenos simultaneamente. Saliva é particularmente atraente nesta aplicação porque é não-invasivo, mais barato e mais fácil de recolher além do soro. Os antigénios de agentes patogénicos ambientais foram acoplados a microesferas carboxiladas (grânulos) e utilizado para medir os anticorpos em volumes muito pequenos de amostras de saliva humana utilizando um ensaio solução-fase à base de grânulo. As esferas foram acoplados com antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovírus (G I.1 e G II.4) e vírus da hepatite A. Para assegurar que os antigénios foram suficientemente acoplado aas contas, o acoplamento foi confirmada usando, anticorpos de captura primária de origem animal espécie-específicos, seguido de incubação com biotinilados anti-espécies anticorpos de detecção secundárias e repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como um controlo para medir a ligação não específica, um conjunto de esferas foi tratada de forma idêntica aos outros, excepto que não foi acoplado a qualquer antigénio. As esferas juntamente com antigénio e de controlo foram então incubados com amostras de saliva humana prospectivamente-recolhidos, medido num analisador de alto rendimento com base nos princípios de citometria de fluxo, e a presença de anticorpos para cada antigénio foi medida em unidades de intensidade média de fluorescência (IMF) . Este imunoensaio multiplex tem um número de vantagens, incluindo mais dados com menos de amostra; redução de custos e de trabalho; e a capacidade de personalizar o ensaio para muitos alvos de interesse. Os resultados indicam que o imunoensaio multiplex salivar pode ser capaz de identificar as exposições e infecções anteriores, que pode ser especially útil em estudos de vigilância envolvendo grandes populações humanas.
Introduction
Oitenta e oito por cento das doenças relacionadas com a diarreia em todo o mundo está associada à exposição humana à água contaminada, alimentos não seguros, e falta de saneamento / higiene, causando cerca de 1,5 milhões de mortes, a maioria dos quais são crianças 1. Esta é uma das principais causas de preocupação para os funcionários de saúde pública e os decisores políticos. Em um esforço para investigar exposições e doenças associadas à base de água e de outros patógenos ambientais, foi desenvolvido um imunoensaio multiplex para medir anticorpos em amostras humanas 2-4. Este método pode ser aplicado a estudos epidemiológicos para determinar a exposição humana para estes agentes patogénicos e para melhor definir e infecções immunoprevalence incidentes.
Saliva é uma promessa considerável como uma alternativa ao soro para pesquisa com biomarcadores humano. Entre as vantagens da utilização de saliva são os não-invasivo e facilidade de recolha de amostras, de baixo custo, e as amostras podem ser facilmente obtidas de crianças 5-7 </ Sup>. As amostras de soro e saliva foram estudados extensivamente para anticorpos contra H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, vírus da hepatite A e C 13-14, noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, vírus da dengue 16, o vírus da imunodeficiência humana (VIH) 17, e Escherichia coli O157: H7 18.
Um imunoensaio em multiplex permite a análise de múltiplos analitos em simultâneo dentro de um único volume de amostra e dentro de um único ciclo ou correr. Antígenos multiplexados de C. jejuni, T. gondii, H. pylori, vírus da hepatite A, e duas noroviruses foram usadas para medir humano IgG salivar 4/2 e IgA IgG no plasma 3,4 e 2,3 respostas de anticorpos para estes agentes patogénicos usando um-Grânulo baseado imunoensaio multiplexação. Quando usado em conjunto com estudos epidemiológicos de exposição a micróbios em água, solo e dos alimentos, do tipo de ensaio descrito neste estudo pode fornecer informação valiosa para melhorar a compreensão de infecções causadas por agentes patogénicos ambientais. Além disso, os dados obtidos a partir de anticorpos salivares tais estudos pode ser usada para melhorar os modelos de avaliação do risco 19-22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estes resultados indicam que o método de imunoensaio em multiplex é útil para discriminar entre amostras de saliva que são imunopositivos ou immunonegative. Para determinar imunopositividade, um único ponto de corte foi desenvolvido através do cálculo da média mais três desvios-padrão do log transformado respostas IFM dos cordões desacoplados de controle testados com todas as amostras de saliva. O ponto de corte proporcionou a capacidade de avaliar a exposição e immunoprevalence a qualquer um único ou vár…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.
Materials
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387 : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori : lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni : heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) | KPL | 16-10-02 | Used for Salivary Immunoassay |
| Consumables | |||
| 1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1000 µL pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
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