Abstract
De etiologie en de effecten van menselijke blootstelling aan omgevingsfactoren ziekteverwekkers zijn wereldwijd grote zorg, en dus zou de mogelijkheid om de blootstelling en infecties met behulp van kosteneffectieve, high-throughput benaderingen te beoordelen onontbeerlijk. Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling en analyse van een korrel-gebaseerde multiplex immunoassay mogelijkheid gelijktijdig de aanwezigheid van antilichamen in menselijk speeksel meerdere pathogenen. Speeksel is bijzonder aantrekkelijk in deze toepassing omdat het invasief, goedkoper en gemakkelijker te verzamelen dan serum. Antigenen van ziekteverwekkers uit de omgeving gekoppeld waarbij gecarboxyleerde microsferen (korrels) en gebruikt om antilichamen in zeer kleine volumes menselijke speekselmonsters met een kraal gebaseerde, oplossing-fase-assay gemeten. Bolletjes werden in combinatie met antigenen van Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirussen (G I.1 en G II.4) en hepatitis A-virus. Opdat de antigenen voldoende gekoppeld terde korrels, werd bevestigd middels koppelmiddelen soortspecifieke, dierlijke primaire invangantilichamen, gevolgd door incubatie met gebiotinyleerd anti-species secundaire detectie antilichamen en streptavidine-R-fycoerythrine reporter (SAPE). Als een controle voor het meten aspecifieke binding werd één kraal set identiek behandeld als de anderen behalve dat niet gekoppeld aan een antigeen. De antigeen gekoppelde en controle parels werden vervolgens geïncubeerd met prospectief verzamelde menselijke speekselmonsters, gemeten op een high throughput analyse gebaseerd op de principes van flowcytometrie, en de aanwezigheid van antilichamen tegen elk antigeen werd gemeten mediane fluorescentie- intensiteit eenheden (MFI) . Deze multiplex immunoassay heeft een aantal voordelen, waaronder meer gegevens met minder monster; lagere kosten en arbeid; en de mogelijkheid om de bepaling te passen aan verschillende doelen plaats. Resultaten geven aan dat de speekselklieren multiplex immunoassay kan identificeren eerdere blootstelling en infecties, wat kan worden especially nuttig in surveillance studies met grote menselijke bevolking.
Introduction
Achtentachtig procent van diarree gerelateerde ziekte wereldwijd wordt in verband gebracht met de blootstelling aan verontreinigde water, onveilig voedsel en slechte sanitaire / hygiëne, waardoor ongeveer 1,5 miljoen doden, van wie de meerderheid zijn kinderen 1. Dit is een belangrijke bron van zorg voor de openbare gezondheid van de ambtenaren en beleidsmakers. In een poging om blootstelling en ziekten die verband houden met water en andere milieu-pathogenen te onderzoeken, ontwikkelden we een multiplex immunoassay om antilichamen in menselijke monsters 2-4 te meten. Deze methode kan worden toegepast epidemiologische studies menselijke blootstelling aan deze pathogenen te bepalen en beter omlijnd en immunoprevalence incidente infecties.
Speeksel houdt aanzienlijke belofte als alternatief voor serum biomarker voor menselijk onderzoek. Onder de voordelen van speeksel zijn de niet-invasieve en gemak van monsterverzameling, lage kosten, en samples gemakkelijk worden opgehaald kinderen 5-7 </ Sup>. Serum- en speekselmonsters werden uitgebreid onderzocht op antilichamen tegen H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, hepatitis virussen A en C 13-14, noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, dengue virus 16, humaan immunodeficiëntievirus (HIV) 17 en Escherichia coli O157: H7 18.
Een multiplex immunoassay maakt de analyse van meerdere analyten tegelijk in één monstervolume binnen een enkele cyclus of lopen. Multiplexverzending antigenen van C. jejuni, T. gondii, H. pylori, werden hepatitis A virus, en twee noroviruses toegepast om menselijke speeksel IgG en IgA 2-4 3,4 en 2,3 plasma IgG antilichaamresponsen meten deze pathogenen met eenBead-based multiplexing immunoassay. Bij gebruik in combinatie met epidemiologische onderzoeken van blootstelling aan microben in water, bodem en voedsel, kan het type assay beschreven in deze studie waardevolle informatie voor het begrijpen van infecties veroorzaakt door ziekteverwekkers uit de omgeving te verruimen. Bovendien kan het speeksel antilichaam gegevens verkregen uit deze studies worden gebruikt om de risico-evaluatie modellen 19-22 te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Goedkeuring werd verkregen van de Institutional Review Board (IRB # 08-1844, Universiteit van North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) voor het verzamelen van gestimuleerde crevicular speekselmonsters van strandgangers in Boquerón Beach, Puerto Rico, als onderdeel van de Verenigde Staten Environmental Protection Agency (US EPA) De nationale Epidemiologische en Environmental Assessment van recreatief (NEEAR) Water Study 23 tot zwemmen bijbehorende risico's en ziekten te beoordelen. Proefpersonen mits informed consent en werden geïnstrueerd over het gebruik van het speeksel collectie apparaat door getrainde USEPA aannemers. De speekselmonsters werden verscheept op ijs en bij ontvangst, werden zij gecentrifugeerd en opgeslagen bij -80 ° C zoals beschreven 4.
1. Bead Activation
- Resuspendeer kralen set voorraden door vortexen en sonificeren gedurende 20 seconden en de overdracht van ongeveer 5,0 x 10 6 van de voorraad kralen (400 ul) naar microcentrifugebuizen.
Opmerking: THij parels worden geleverd in een concentratie van 12,5 x 10 6 kralen / ml. - Pellet de voorraad parels door centrifugeren bij 10.000 xg gedurende 2 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de gepelleteerde kralen in 100 ul gedistilleerd water (dH 2 O) van vortex en sonicatie gedurende 20 sec. Herhaal stap 1.2.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de gewassen parels in 80 pl 100 mM monobasisch natriumfosfaat, pH 6,2 door vortex en sonicatie gedurende 20 sec.
- Vlak voor het gebruik maken van een oplossing 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) door toevoeging van 200 pl dH 2 O tot de 10 mg sulfo-NHS aliquot. Meng door vortex.
- Voeg 10 ul van 50 mg / ml sulfo-NHS aan de korrels. Meng door vortex.
- Vlak voor het gebruik maken van een 50 mg / ml 1-ethyl- [3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) door toevoeging van 200 ul gedestilleerd water (dH 2 O) aan de 10 mg EDC aliquot. Meng door vortex.
- Voeg 10 ul van 50mg / ml EDC oplossing van de kralen. Meng door vortex. Incubeer de kralen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker onder mengen door vortex op 10 min intervallen. Pellet de geactiveerde korrels door microcentrifugatie bij 10.000 xg gedurende 2 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 250 ui 50 mM 2- [N -Morpholino] ethaansulfonzuur (MES), pH 5,0 door vortex en sonicatie gedurende 20 sec.
- Pellet de geactiveerde korrels door microcentrifugatie bij 10.000 xg gedurende 2 minuten.
- Herhaal stap 1.9 en 1.10.
Opmerking: Dit levert een totaal van twee wassingen met 50 mM MES, pH 5,0. - Resuspendeer de kralen in 100 pi 50 mM MES, pH 5,0 door vortex en sonicatie gedurende 20 sec.
2. Bead Koppeling
- Stel de antigenen aan de korrel sets in met de in Tabel 1 concentraties.
- Voeg elk antigeen aan de geactiveerde kralen en breng het totale volume op 500 pl in 50 mM MES, pH 5,0. Meng de antigenen eend kralen door vortex.
- Incubeer de antigenen en de parels gedurende 2 uur onder mengen door rotatie (~ 15 rpm) bij kamertemperatuur in het donker. Pellet de gekoppelde korrels door microcentrifugatie bij 10.000 xg gedurende 2 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 500 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) -bovine serumalbumine (BSA) -polyoxyethylenesorbitan monolauraat (Tween-20) natriumnitraat azide (PBS-TBN) pH 7,4 door vortex en sonicatie. Pellet de kralen door microcentrifugatie bij 10.000 xg gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant.
Let op: Natriumazide is een acuut giftig chemisch product. Het is dodelijk bij inslikken of in contact komt met de huid. Voorkom inademen van stof / rook / gas / nevel / damp of spray. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) bij het hanteren en afvoeren in overeenstemming met de relevante wetten. - Resuspendeer de kralen in 1 ml PBS-TBN van vortex en sonicatie gedurende 20 sec.
- Pellet de korrels door microcentrifugatie bij 10.000 xg gedurende 2 minuten.
- Herhaal de stappen 2,5 en 2,6.
Opmerking: Dit levert een totaal van twee wassingen met PBS-TBN. - Resuspendeer de gekoppelde en gewassen kralen in 1 ml PBS, 1% BSA, 0,05% azide, pH 7,4. Bewaar de gekoppelde parels in een 2-8 ° C koelkast in het donker.
3. Bead Count
- Bereid een 1:10 verdunning van de gekoppelde korrels in water of PBS buffer.
- Load 10 ul van de verdunning kraal op een hemocytometer op monsterintroductie punt.
- Tel de korrels gezien in één van de 4 x 4 corner roosters. Bereken het aantal gekoppelde korrels met de volgende formule: Count (1 hoek van 4 x 4 raster) x (1 x 10 4) x (verdunningsfactor) x resuspensie in ml.
4. Bevestiging van de Antigen Coupling
- Resuspendeer de voorraad mengsel van kralen gekoppeld aan antigenen van rente door vortex en sonicatie gedurende 20 sec.
- Bereid een werkende kraal mengsel door verdunning van de gekoppelde kraal voorraden tot een definitieveconcentratie van 100 kralen / ul van elke unieke kralen in PBS-1% BSA (PBS-1% BSA, pH 7,4).
- Maak minstens 7 tweevoudige seriële verdunningen van anti-species IgG primaire antilichaam volgens de aanbevelingen van de fabrikant in 96-well rondbodem plaat met PBS-1% BSA buffer.
- Pre-nat afzonderlijke 8-putjes kolom (8 rijen) van een 96-well filter bodemplaat voor elke test antigen koppeling bevestiging met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. Voeg 50 ul van werken bead mengsel (-antigen gekoppelde korrels) in de pre-nat putjes.
- Voeg 50 ul antilichaam verdunningen 1-7 rijen van elke kolom van de 96-well filterplaat en 50 pi PBS-1% BSA buffer rij 8 in plaats van verdund antilichaam te dienen als achtergrond putjes. Meng met een multi-kanaal pipet op en neer te pipetteren 5 keer. Voer dezelfde procedure voor elk antigeen gekoppeld kraal set te worden bevestigd.
- Dek af en laat incubeer in het donker bij kamertemperatuurerature gedurende 1 uur op een microplaat schudinrichting bij 500 rpm. Verwijder supernatant door vacuüm.
- Was de putjes met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. 1x herhalen. Resuspendeer de kralen in 50 ul PBS-1% BSA met een multi-channel pipet.
- Verdun gebiotinyleerd anti-species IgG secundaire detectie antilichaam tegen 16 ug / ml in PBS-1% BSA.
- Voeg 50 pl verdund secundair antilichaam aan elk putje door en neer te pipetteren 5 keer.
- Bedek filterplaat en laat incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een plaat schudder. Verwijder supernatant door vacuüm. Was de putjes met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. Herhaal wassen 1x.
- Resuspendeer de kralen in 50 ul PBS-1% BSA met een multi-channel pipet.
- Verdunde streptavidine-R-fycoerythrine reporter (SAPE) tot 24 ug / ml in PBS-1% BSA.
- Voeg 50 ul van reporter aan elk putje en meng door en neer te pipetteren 5 keer.
- Cvia filterplaat en laat incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een plaat schudder. Verwijder supernatant door vacuüm. Was de putjes met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. Herhaal wassen 1x.
- Resuspendeer kralen in 100 ul PBS-1% BSA en geanalyseerd 50 gl met de analysator 29.
Opmerking: De resultaten van de kraal-gebaseerde multiplex immunoassay worden gemeten in Median Fluorescence Intensity (MFI). Raadpleeg altijd de meest recente versie van de software handleiding, indien beschikbaar om fouten te voorkomen.
5. Speeksel Multiplex Immunoassay
- Verwijderen speeksel uit de -80 ° C vriezer en laten ontdooien bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer antigen gekoppeld kralen voorraden door vortex en sonicatie gedurende 20 sec.
- Maak een werkoplossing door verdunning kraal mengsel de gekoppelde kraal voorraden tot een uiteindelijke concentratie van 100 kralen / ul van elke unieke set kralen in PBS-1% BSA buffer.
- Maak een 1: 4 verdunning van speeksel wet PBS-1% BSA buffer in een 96 well, diepe put plaat.
- Pre-nat filter plaat met 100 ul wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm.
- Voeg 50 ul van een werkende korrel mengsel en een gelijk volume verdund speeksel 95 putjes van de 96 putjes filterplaten een 1: 8 eindverdunning. Meng reacties met een multi-channel pipet. De ene controleputje, voeg 50 ul antigen gekoppelde korrels plus 50 pi PBS-1% BSA buffer (ter vervanging van speeksel).
- Dek af en laat incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een microplaat schudinrichting bij 500 rpm. Verwijder supernatant door vacuüm. Was de putjes met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. Herhaal wassen 1x.
- Resuspendeer kralen in 50 ul PBS-1% BSA met een multi-channel pipet.
- Verdun gebiotinyleerd geit anti-humaan IgG secundair antilichaam voor detectie 16 ug / ml in PBS-1% BSA.
- Voeg 50 ul verdund secundair antilichaam aan elk putje en meng de inhoud meteen multi-channel pipet.
- Bedek filterplaat en laat incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een plaat schudder. Verwijder supernatant door vacuüm. Was de putjes met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. Herhaal wassen 1x.
- Resuspendeer kralen in 50 ul PBS-1% BSA met een multi-channel pipet.
- Verdunde streptavidine-R-fycoerythrine reporter (SAPE) tot 24 ug / ml in PBS-1% BSA.
- Voeg 50 ul aan elk putje reporter en meng met een multi-channel pipet.
- Bedek filterplaat en laat incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een plaat schudder. Verwijder supernatant door vacuüm. Was de putjes met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. Herhaal wassen 1x.
- Resuspendeer kralen in 100 ul PBS-1% BSA en geanalyseerd 50 gl met de analysator 29.
Opmerking: De resultaten van de multiplex immunoassay worden gemeten in Median Fluorescence Intensity (MFI) eenheden. Raadpleeg altijdde nieuwste versie van de software manual, indien beschikbaar om fouten te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een unieke kraal set werd gebruikt als een controle om niet-specifieke binding te meten en het monster van de variabiliteit proeven. Deze bolletjes werden identiek behandeld om het antigeen gekoppeld kralen met de uitzondering dat ze niet werden geïncubeerd met elk antigeen in de koppelingsstap. MFI-waarden> 500 verkregen uit de controle kralen geïncubeerd met alle speekselmonsters werden verwijderd uit verdere analyses vanwege vermoedelijke besmetting uit serum en de resterende reacties waren logboek verdeeld. Het speeksel kan worden besmet met serum als het tandvlees te krachtig gewreven met de spons aan de verzamelinrichting of de studie deelnemer parodontitis. De log-getransformeerde MFI-gegevens werden gebruikt om een immunopositive afkappunt van 505 MFI gebaseerd op de gemiddelde plus 3 standaarddeviaties van de log MFI-waarden te berekenen. Bovendien werden antigeen gekoppeld kralen toegevoegd aan specifieke putjes die als testputten behandeld op elke manier behalve dilbijge- speeksel werd vervangen door PBS-1% BSA tot achtergrondfluorescentie en kruisreactiviteit evalueren. De MFI waarden verkregen in deze achtergrond wells werden afgetrokken van de MFI-waarden van elk antigeen gekoppeld kraal set voor elk speeksel monster.
Parel koppeling werd bevestigd met behulp van dierlijke species-specifieke primaire detectie antilichamen die specifiek zijn voor elk antigeen. Opdat het antigeen gekoppelde korrels konden benaderen het dynamische bereik van de assay, we gedefinieerd juiste koppeling als MFI ≥18,000, observatie van dosis respons en kruisreactiviteit tussen de primaire antilichamen en niet-doelwitten van <10% zoals beschreven 2 . Vertegenwoordiger koppeling bevestigingen voor C. jejuni en T. gondii van de antigenen in de test zijn weergegeven in figuur 1.
Op basis van de vastgestelde (505 MFI) cut-off point, de immunoprevalence rates voor de monsters (n = 2078) varieerde van ongeveer 2% (n = 41) voor T. gondii tot bijna 50% (n = 1009) voor norovirus GI.1 (figuur 2). De gegevens geven aan dat de immunoprevalence zich het meeste van de noroviruses gevolgd door het hepatitis A-virus en H. pylori.
Terwijl 32% (n = 672) van de monsters werden immunonegative voor alle ziekteverwekkers in het assay 68% (n = 1406) werden immunologisch één of meer pathogenen. Figuur 3 toont de verdeling van immunopositivity één of meer van de ziekteverwekkers.
Figuur 1: Koppeling bevestiging analyses voor twee van de organismen in de multiplex immunoassay koppeling bevestiging werd uitgevoerd voor elk van de antigenen en de grafieken voor C.. jejuni en T. gondii in deze figuur zijn vertegenwoordiger van de koppeling bevestigingen voor de antigenen in de multiplex immunoassay. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Immunoprevalence specifieke pathogenen Immunoprevalence specifieke pathogenen in de multiplex immunoassay varieerde van ongeveer 2% voor T. gondii tot bijna 50% voor norovirus GI.1. Antilichamen tegen het norovirus antigenen werden vaker waargenomen, gevolgd door HAV (hepatitis A virus) en H. pylori. T. gondii en C. jejuni antilichamen bleken minder vaak in het speeksel monsters geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van th bekijkenis figuur.
Figuur 3:. Verdeling immunopositivity meerdere pathogenen gelijktijdig de multiplex immunoassay maakt de analyse van immunopositivity meerdere pathogenen gelijktijdig in een 50 ul monstervolume. Bijna een derde van de speekselmonsters getest was immunonegative voor antilichamen tegen alle van de antigenen in de multiplex. Ongeveer 31% van de monsters was immunopositive voor één antigeen terwijl een kwart positief was twee antigenen. 9,4% was immunopositive drie antigenen. 3% was positief voor vier of meer antigenen tegelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antigeen | Bead Set | koppelbuffer | Ag Concentratie (ug) | # Van kralen in 1 hoek | # Kralen / ul | Vol. 100 B / uL gedurende 4 ml (pl) |
| C. jejuni | 8 | MES 5.0 | 50 | 64 | 6400 | 94 |
| H. pylori | 33 | MES 5.0 | 25 | 71 | 7100 | 85 |
| Hepatitis A | 42 | MES 5.0 | 100 | 91 | 9100 | 66 |
| T. gondii | 30 | MES 5.0 | 25 | 85 | 8500 | 71 |
| norovirus GII.4 | 55 | MES 5.0 | 5 | 72 | 7200 | 83 |
| norovirus GI.1 | 67 | MES 5.0 | 5 | 63 | 6300 | 95 |
| ontkoppeld | 80 | MES 5.0 | 60 | 6000 | 100 | |
| Totaalvolume van kralen (pl) | 594 | |||||
| Totale benodigde buffer (pl) | 3406 | |||||
Tabel 1:. Werken bead mix voor de multiplex immunoassay Na koppeling en bevestiging werden voltooid, een master mix die bestaat uit elke kraal set werd bereid zoals getoond. De master mix werd verdeeld onder eenll van de putjes in de plaat met 96 putjes. Alle putjes werden geïncubeerd met speeksel met uitzondering van een achtergrondcontrole en die op kralen en PBS-1% BSA buffer bevatte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze resultaten geven aan dat de multiplex immunoassay werkwijze nuttig voor het onderscheiden tussen speekselmonsters die immunologisch of immunonegative zijn. Om immunopositivity te bepalen werd een cut-off point ontwikkeld door berekening van het gemiddelde plus drie standaardafwijkingen van de log-getransformeerde MFI reacties van de besturing gekoppelde parels getest met alle speekselmonsters. De cut-off point leverde de mogelijkheid van blootstelling en immunoprevalence beoordelen in een enkele of meerdere pathogenen. Dit onderscheidend vermogen kan nuttig zijn bij studies bevolking gezondheidsrisico's in verband met blootstelling aan omgevingstabaksrook en andere pathogenen onderzoeken.
Er zijn verschillende andere methoden die kunnen worden gebruikt om een uitschakelpunt bepalen aan de verdeling van de MFI ontkoppelde bedieningselementen en vraag de studie ontworpen om te beantwoorden. Enkele voorbeelden voor het bepalen van cut-offs zijn onder andere eindige gemengde modellering 24-26, bedoel plus 3standaardafwijkingen van de reacties met controles, gemiddelde plus 2 standaardafwijkingen van de reacties met controles, en drie keer de gemiddelde reacties controles 27,28. Voor eenvoudige screenings, kunnen minder strenge criteria worden gebruikt, maar voor epidemiologische studies, kan het beter zijn om een strengere definitie gebruiken om de waarschijnlijkheid van de rapportage valse positieven te verminderen. Onze eerste applicatie is te kijken naar immunoconversion en immunoprevalence tussen zwemmers en niet-zwemmers. In dit onderzoek werden de ontkoppelde control MFI niet normaal verdeeld en de resultaten werden log getransformeerd.
Voordelen voor het uitvoeren van een multiplex-korrel gebaseerde immunoassay omvat het gebruik van zeer lage monstervolumes, vermindering van tijd en arbeid en de mogelijkheid om reacties gelijktijdig meten tot 500 analyten met de vereiste dat een minimale hoeveelheid reagentia. Daarentegen traditionele methoden voor de evaluatie antilichaamspiegels indicatief bestraling en / of infectie (bv
Beperkingen van een multiplex immunoassay onder meer de noodzaak van strenge optimalisatie om de optimale concentratie van de primaire en secundaire capture detectie antilichamen, antigenen en verslaggever bepalen. Kruisreactiviteit is ook een groot probleem in immunoassays antilichamen tegen een bepaald antigeen kan kruisreageren met antigenen van andere organismen en daardoor leiden tot vals positieve aflezingen. Optimalisatie werden kruisreactiviteit en aspecifieke binding reeds 2-4 behandeld. Het succes van een dergelijke assay is grotendeels afhankelijk van de mogelijkheid om zeer immunogene antigenen te verkrijgen en specifieke Antibosterft deze antigenen voor gebruik in de kraal koppeling en koppeling bevestiging stappen. Een andere beperking is de beperkte beschikbaarheid van het kenmerk (diagnostisch positieve en negatieve) monsters aan de testen te valideren.
Er zijn een aantal kritische stappen in het protocol. Deze omvatten: het op antigenen die worden gekoppeld aan de korrels doen vreemde eiwitten, azide, glycine, Tris of primaire aminen bevatten. Wanneer één van deze middelen bestaan in het antigeenpreparaat, moeten deze worden verwijderd door dialyse of chromatografie. Het wordt aanbevolen dat men moet beginnen met 5 ug antigeen per 5.000.000 kralen en titreren om de optimale concentratie te vinden. Kies de optimale detectie-antilichaamconcentratie dat de beste gevoeligheid en dynamisch bereik geeft. Houd in gedachten dat de signalen de neiging om te dalen als antigen en detectie antilichaamconcentraties stijging (hook effect). Bijvoorbeeld, als het signaal afneemt als antigeen concentratie toeneemt automatisch gevondenion antilichaam kan worden beperkt. Omgekeerd, als signalen afnemen als detectie antilichaam toeneemt dan reporter (SAPE) kan beperken. Controleer de multiplex voor cross-reactiviteit door het combineren van de optimale koppeling voor elk eiwit (5000 van elke set per well bead). Test de gemultiplexte kraal sets door vermenging met de optimale detectie antilichaam bedrag. Optimaliseer de verslaggever en een standaard curve van het antigeen door het testen van elk antigeen afzonderlijk.
Problemen met een multiplex immunoassay om de gevoeligheid te verbeteren en de mediane fluorescent signaal te verhogen zijn van cruciaal belang. Om de gevoeligheid te verbeteren, te verminderen of de hoeveelheid antigeen gekoppeld aan de korrels of de detectie antilichaamconcentratie. Het gebruik van een hogere affiniteit antilichaam voor het vangen en / of detectie kan ook gevoeligheid verbeteren. Verhogen van de hoeveelheid antigeen gekoppeld met de kralen kunnen de mediane fluorescentiesignaal stijgen. Een studie toonde aan dat pre-incubatie serummonsters met polyvinylalcohol plus polyvinylpyrrolidon (PVX) buffer kan niet-specifieke binding in serologische tests met de bead-based multiplex assay 30 onderdrukken, zoals degene die we hier beschrijven. Echter, een andere studie van onze medewerkers vonden geen significant effect tussen de PBS-BSA en PVX buffers. Zij verder dat vanwege de hogere viscositeit van het PVX buffer, deze problemen kraal acquisitie in de analysator en gevormd schuim in de microtiterplaat putjes 3 gemaakt gesloten.
Concluderend hebben wij voorgesteld een methode die kan meten de aanwezigheid van humaan speeksel IgG antilichamen tegen meerdere pathogenen gelijktijdig in een zeer klein monstervolume. In de toekomst zal deze assay worden gebruikt om de aanwezigheid van speeksel antilichamen geassocieerd met zwemmen blootstellingen of besmettingen en om te informeren risicoanalysemodellen. Bovendien kan de test worden gebruikt om antilichamen in verband gebracht met de lucht en voedsel overgedragen BELICHTI metenes, bepalen incident infecties of immunoconversions en een kritische immunologische informatie aan epidemiologen uitvoeren vragenlijst-type bevolking studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De United States Environmental Protection Agency via haar Bureau voor Onderzoek en Ontwikkeling gefinancierd en beheerd de hier beschreven onderzoek. Het is onderworpen aan een administratieve herziening van het Agentschap en goedgekeurd voor publicatie. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten geen goedkeuring of aanbeveling voor het gebruik opleveren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus: p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387: p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori: lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni: heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Consumables | |||
| 1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µl pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µl pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1,000 µl pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
References
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
- Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
- Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
- Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
- Ferguson, D.
- Mandel, I.
- Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
- Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
- Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
- Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
- Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
- Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
- Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
- Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
- Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
- Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
- Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
- Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
- Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
- Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
- Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
- Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
- Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
- Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
- Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
- Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
- Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
- Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
- Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
- Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).
