Imagerie cellulaire Viabilité sur Echafaudages non transparents - Utilisation de l'exemple d'un roman en maille de titane Implant
Summary
Nous présentons ici une technique d'imagerie fluorophore sur la base pour détecter la viabilité des cellules sur un échafaudage en titane non-transparent, ainsi que pour détecter des aperçus des impuretés d'échafaudage. Ce protocole répare l'inconvénient d'imager les interactions cellule-cellule ou cellule-métal sur des échafaudages non transparents.
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
La lombalgie chronique est une maladie multifactorielle. L'intérêt dans une option de traitement peu invasif pour la maladie dégénérative du disque a augmenté depuis les années 1950. Jusqu'à aujourd'hui, la fusion de plusieurs segmentaire de la colonne vertébrale est le traitement le plus largement utilisé. Depuis, cette méthode conduit souvent à des limitations de la mobilité du segment affecté 1,2, l' exploration de l'ère de l' arthroplastie est devenu un grand intérêt. Des progrès considérables en remplacement de disque et le noyau remplacement total est devenu une bonne alternative pour traiter les douleurs chroniques au dos 1. Malgré les énormes progrès, aucune des méthodes a été évaluée cliniquement. Les implants de noyaux moins rigides représentent une alternative prometteuse pour le remplacement total du disque, à condition que l'anneau fibreux est intact 3,4. Cependant, les implants actuellement présents noyau sur le marché sont souvent associées à des complications comme les changements dans le corps vertébral, dislocation, vertical perte du disque et t la hauteuril manque de nécessaire rigidité mécanique associée 5. Afin de pallier aux inconvénients actuels, un nouvel implant de noyau en fils tricotés de titane a été développé avec succès 6. En raison de la structure tricotée unique, cet échafaudage nouvellement développé a montré des caractéristiques biomécaniques distingués, par exemple, fonction d' amortissement, la taille des pores, la capacité de chargement et de fiabilité 7. Dans le but de tester la biocompatibilité de ce nouvel implant de noyau, représenté dans les limites sévères (optique) des techniques d'analyse attribuées à caractère non transparent de l'implant.
Afin de tester la biocompatibilité, l' interaction cellule-métal joue un rôle prépondérant 10/08. Une interaction entre les cellules et l'échafaudage est nécessaire pour la stabilisation et par conséquent pour l'intégration de l'implant mieux dans le système hôte. Cependant, une augmentation de la profondeur de croissance intérieure peut altérer les propriétés mécaniques de l'échafaudage. Visant à investigate si la surface de l'échafaudage fournit une base pour la fixation cellulaire, la prolifération et la différenciation ou si le métal affecte la viabilité des cellules, il est important de résoudre le problème commun bien connu de l'imagerie de cellules sur / dans les échafauds non transparentes et opaques. Afin de surmonter cette limitation plusieurs fluorescent techniques basées ont été explorées. Les entreprises offrent une large gamme de fluorophores pour visualiser les cellules vivantes, des compartiments cellulaires, ou des états cellulaires spécifiques même 11. Fluorophores pour cette expérience ont été choisis avec l'aide de l'outil visualiseur spectrale en ligne afin d'adapter au mieux notre microscope fluorescent.
La stratégie développée pour l'analyse des cellules comportement adhérent sur / dans l'échafaudage de titane tricoté non-transparent comprend les éléments suivants: 1) fluorescent (protéine fluorescente verte / GFP) marquage des cellules osteochondro-progénitrices pour permettre le suivi des cellules sur la échafaud, 2) la mesure de la viabilité (mitoactivité chondrial) des cellules, et 3) la visualisation de cellule à cellule et des interactions cellulaires matériau au sein de l'échafaudage. La procédure présente l'avantage qu'il peut être facilement transféré à d'autres cellules adhérentes et autres échafaudage non transparente ou opaque. En outre, la viabilité et la structure de croissance interne peuvent être contrôlés pendant plusieurs jours, il peut donc être utilisé avec des quantités limitées de matériau d'échafaudage ou de cellules.
La présente étude démontre l'utilisation réussie de notre protocole actuel pour mesurer la viabilité cellulaire et de visualiser modèle dans la croissance des cellules progénitrices osteochondro-sur / dans l'échafaudage de titane tricoté non-transparent. En outre, les protocoles développés pourraient être utilisés afin de déterminer les impuretés d'échafaudage et de vérifier les protocoles de nettoyage.
Protocol
Representative Results
Discussion
La surface de l' échafaudage joue un rôle important dans son interaction avec les tissus environnants in vivo , en déterminant ainsi la longévité des implants fonctionnels. Par conséquent, la biocompatibilité de l'échafaudage est étudié par des essais in vitro en utilisant des cellules (lignée cellulaire SCP1), lorsque plaqué sur les échafauds.
techniques de microscopie qui fonctionnent bien avec échafauds minces et optiquement transparents sont mal ad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le projet est financé en partie par Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. La taxe de publication a été couvert par le traumatisme hôpital BG Tübingen, Allemagne.
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What’s new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Buck, A. E., Kaps, H. -. P. Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. . Optical Techniques in Regenerative Medicine. , (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- . Thermofisher Fluorescence Spectraviewer Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016)
