Viabilidade imagens de células em Scaffolds não-transparentes - usando o exemplo de um Titanium Implant Novel malha
Summary
Aqui nós apresentamos uma técnica de imagem fluoróforo base para detectar a viabilidade celular em um andaime de titânio não-transparente, bem como para detectar vislumbres das impurezas de andaime. Este protocolo soluciona o problema de imagiologia de interacções célula-célula ou célula-metal em andaimes não transparentes.
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
dor lombar crônica é uma doença multifatorial. O interesse em uma opção de tratamento minimamente invasivo para a doença degenerativa do disco tem crescido desde a década de 1950. Até hoje, a fusão de múltiplos segmentos da coluna vertebral é o tratamento mais amplamente utilizado. Desde então, este método muitas vezes leva a limitações na mobilidade do segmento acometido 1,2, exploração da era artroplastia tornou-se um grande interesse. Avanços significativos em substituição total substituição do disco e do núcleo tornou-se uma boa alternativa para o tratamento da dor lombar crônica 1. Apesar do enorme progresso, nenhum dos métodos foi clinicamente avaliada. Os implantes de núcleo menos rígidas representam uma alternativa promissora para a substituição total do disco, desde que o anel fibroso está intacta 3,4. No entanto, os presentes atualmente implantes núcleo no mercado são muitas vezes associada a complicações como alterações no corpo vertebral, deslocamento, perda de altura vertical do disco e tele falta de necessária rigidez mecânica associada 5. A fim de ultrapassar os inconvenientes actuais, um novo implante núcleo feito de fios de malha de titânio foi desenvolvido com êxito 6. Devido à estrutura única de malha, este andaime desenvolvido recentemente demonstrou características biomecânicas distintos, por exemplo, característica de amortecimento, dimensão do poro, a capacidade de carga e de fiabilidade 7. Com o objetivo de testar a biocompatibilidade desta novela implante núcleo, representado severas limitações nas técnicas de análise (óptico) atribuídos à natureza não-transparente do implante.
A fim de testar a biocompatibilidade, interacção célula-de metal desempenha um papel proeminente 8-10. Uma interacção entre as células e o andaime é necessária para a estabilização e, consequentemente, para uma melhor integração do implante dentro do sistema hospedeiro. No entanto, uma profundidade crescente crescimento interno pode alterar as propriedades mecânicas do andaime. Com o objetivo de investigar se a superfície de andaime fornece uma base para a fixação das células, proliferação e diferenciação ou se o metal afeta a viabilidade das células, é importante para solucionar o problema comum bem conhecida de imagiologia células na / em andaimes não-transparentes e opacas. A fim de superar esta limitação vários fluorescente foram exploradas técnicas baseadas. Empresas oferecem uma grande variedade de fluoróforos para visualizar as células vivas, compartimentos celulares, ou mesmo estados celulares específicos 11. Fluoróforos para esta experiência foram escolhidos com a ajuda da ferramenta de visualizador espectral on-line, a fim de melhor atender nosso microscópio fluorescente.
A estratégia desenvolvida para a análise do comportamento de células aderentes em / no andaime de titânio malha não transparente envolve o seguinte: 1) fluorescente (proteína fluorescente verde / GFP) rotulagem das células osteochondro-progenitoras para permitir o rastreamento das células na andaime, 2) a medição da viabilidade (Mitoactividade condral) das células, e 3) a visualização de célula-célula e as interacções das células-prima dentro do andaime. O procedimento tem a vantagem de que ele pode ser facilmente transferido para outras células aderentes e outras andaime não transparente ou opaca. Além disso, a viabilidade e crescimento interno do padrão pode ser monitorizada ao longo de vários dias, assim, ela pode ser usada com quantidades limitadas de material de andaime ou células.
O presente estudo demonstra o uso bem sucedido do nosso protocolo atual para medir a viabilidade celular e visualizar padrão no crescimento de células progenitoras osteochondro-on / no não-transparente scaffold titânio malha. Além disso, os protocolos desenvolvidos pode ser utilizado a fim de determinar as impurezas de andaime e para verificar os protocolos de limpeza.
Protocol
Representative Results
Discussion
A superfície andaime desempenha um papel importante na sua interacção com o tecido circundante in vivo, determinando assim implantes durabilidade funcional. Assim, a bio-compatibilidade do andaime é estudada por ensaios in vitro utilizando células (linha de células SCP1), quando plaqueadas sobre os andaimes.
técnicas de microscopia que funcionam bem com andaimes finas e opticamente transparentes são pouco adequados para andaimes não transparentes para estudar a bio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projeto é parcialmente financiado pelo Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. A taxa de publicação foi coberta pelo trauma do hospital BG Tübingen, Alemanha.
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
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