Şeffaf olmayan iskelelerinin üzerinde Görüntüleme Hücre Canlılık - Roman Örme Titanyum İmplant Örnek Kullanımı
Summary
Burada bir şeffaf olmayan titanyum iskele üzerinde hücre canlılığını tespit etmek yanı sıra iskele yabancı maddelerin Glimpses tespit etmek için bir fluorofor tabanlı görüntüleme tekniği sunuyoruz. Bu protokol, saydam olmayan iskeleler üzerine hücre-hücre ya da hücre-metal etkileşimleri görüntüleme dezavantajına giderir.
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
Kronik sırt ağrısı çok faktörlü bir hastalıktır. dejeneratif disk hastalığı için minimal invaziv bir tedavi seçeneği olarak ilgi 1950'lerden beri büyüdü. Bugün, omurganın çoklu segmental füzyon en yaygın kullanılan tedavi kadar. Bu yana, bu yöntem genellikle etkilenen segmentin 1,2 hareketliliği sınırlamalar yol açar, artroplasti dönemin keşif geniş bir ilgi oldu. Toplam disk değiştirme ve çekirdek yerine önemli gelişmeler kronik bel ağrısı 1 tedavi etmek için iyi bir alternatif haline gelmiştir. Büyük gelişmelere rağmen, yöntemlerin hiçbiri klinik değerlendirilmiştir. Daha az sert çekirdek implantlar, toplam disk değiştirme için umut verici bir alternatifi temsil anulus fibrosus 3,4 bozulmamış olması koşuluyla. Ancak, şu anda piyasada mevcut çekirdek implantlar genellikle vertebral cismin, çıkık, disk ve t dikey yüksekliği kaybına değişiklikleri gibi komplikasyonlar ile ilişkiliGerekli ilişkili mekanik sertliği 5 o eksikliği. Mevcut dezavantajların üstesinden gelmek için, örgü titanyum tellerden oluşan yeni bir çekirdeği implant başarıyla 6 geliştirilmiştir. Nedeniyle eşsiz örme yapısı, bu yeni geliştirilen iskele gibi seçkin biyomekanik özellikleri, sönümleme özelliği, gözenek boyutu, yükleme kapasitesi ve güvenilirlik 7 göstermiştir. Bu yeni çekirdek implantın biyouyumluluk test etmek hedefleyen, implantın şeffaf olmayan doğaya atfedilen (optik) analiz teknikleri ciddi sınırlamalar tasvir.
Biyouyumluluk test etmek için, hücre metali etkileşimi önemli bir rol 8-10 oynar. hücreleri ve iskele arasında bir etkileşim konak sistemi içinde daha iyi implant entegrasyonu için istikrar ve dolayısıyla için gereklidir. Ancak, artan büyümesi derinlik iskele mekanik özelliklerini değiştirebilir. inves hedefleyeniskele yüzey hücre eki, çoğalması ve farklılaşması veya bir temel sağlar olmadığını araştırılmazsa metal hücre canlılığı etkileyip etkilemediğini, bu şeffaf olmayan ve opak iskeleleri / 'üzerinde görüntüleme hücreleri ortak tanınmış sorunu gidermek için önemlidir. Bu sınırlama birkaç floresan üstesinden gelmek için dayalı teknikler incelenmiştir. Şirketler canlı hücreler, hücre bölmeleri, hatta spesifik hücresel devletler 11 görselleştirmek için fluorophores geniş bir ürün yelpazesi sunuyoruz. Bu deney için fluorophores en iyi şekilde floresan mikroskop sığdırmak için online araç spektral izleyici yardımıyla seçildi.
üzerinde hücrelerin izleme sağlamak için osteochondro-projenitör hücrelerin 1) flüoresan (yeşil floresan protein / GFP) etiketleme: şeffaf olmayan örme titanyum iskele üzerine / içine yapışan hücreler davranış analizi için geliştirilmiş stratejisi aşağıdaki kapsar iskele, 2) canlılığını ölçen (mitochondrial aktivite) hücreleri, ve 3) görselleştirme hücre-hücre ve iskele içinde hücre materyal etkileşimleri. Prosedür kolayca diğer yapışık hücreler ve diğer non-saydam veya opak iskele aktarılabilir avantajına sahiptir. Ayrıca, canlılık ve içe büyüme paterni birkaç gün içinde izlenebilir, bu nedenle iskele malzemesi veya hücrelerin sınırlı bir miktarda kullanılabilir.
Bu çalışmada hücre canlılığı ölçmek ve şeffaf olmayan örme titanyum iskele / 'üzerinde osteochondro-progenitör hücrelerin in-büyüme modeli görselleştirmek için mevcut protokol başarılı kullanımını gösterir. Ayrıca, geliştirilen protokoller iskele kirleri belirlemek ve temizlik protokolleri kontrol etmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Iskele yüzeyi bu şekilde implantlar, fonksiyonel dayanıklılığı belirlemek in vivo çevreleyen doku ile etkileşimlerinde önemli bir rol oynar. Böylece, yapı iskeletinin biyo-uyumluluk iskeleler üzerine kaplanır hücreler kullanılarak in vitro deneylerde (SCP1 hücre hattı) ile incelenmiştir.
ince ve optik olarak transparan iskeleleri ile iyi işlev mikroskopi teknikleri kötü biyouyumluluk incelemek için şeffaf olmayan iskeleleri için uygundur. Bu saydam …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Proje kısmen Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4 tarafından finanse edilmektedir. yayın ücreti BG travma hastane Tübingen, Almanya tarafından kapatılmıştır.
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What’s new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Buck, A. E., Kaps, H. -. P. Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. . Optical Techniques in Regenerative Medicine. , (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- . Thermofisher Fluorescence Spectraviewer Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016)
