כדאיות התא הדמיה על פיגומים ללא שקוף - לפי הדוגמה של שתל טיטניום סרוגה Novel
Summary
כאן אנו מציגים טכניקת הדמיה המבוססת fluorophore לזהות כדאיויות תא על גבי פיגום טיטניום שאינו שקוף כמו גם לזהות הבזקים של זיהומי הפיגום. פרוטוקול זה troubleshoots החיסרון של הדמיה תאים תאים או תאים אינטראקציות-מתכת על פיגומים שאינם שקופים.
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
כאבי גב כרוניים הוא מחלה מולטיפקטוריאלית. ההתעניינות אפשרות טיפול זעיר-פולשני עבור מחלת דיסק ניוונית גדלה מאז 1950. עד היום, היתוך רב-סגמנטלי של עמוד השדרה הוא הטיפול הנפוץ ביותר. מאז, שיטה זו מובילה לעיתים קרובות מגבלות בניידות של המגזר מושפע 1,2, חקר של עידן המפרק הפך עניין רחב. התקדמות משמעותית החלפת גרעין החלפת דיסק כוללת הפכה אלטרנטיבה טובה לטיפול בכאב 1 גב כרוני. למרות ההתקדמות הענקית, אף אחת מהשיטות נבדקו קליני. פחות שתלי הגרעין הנוקשים לייצג חלופה מבטיחה החלפת דיסק כוללת, ובלבד fibrosus annulus הוא תם 3,4. עם זאת, שתלי הגרעין הנוכחיים כיום בשוק הקשורים לעתים קרובות עם סיבוכים כמו שינויים בגוף בחוליות, פריק, אובדן גובה אנכי של הדיסק tהוא חוסר נוקשות 5 המכנים קשורות צורך. על מנת להתגבר על החסרונות הנוכחיים, שתל גרעין רומן עשויים חוטי טיטניום סרוגים פותח 6 בהצלחה. בשל המבנה הסרוג הייחודי, פיגום חדש שפותח זה הוכיח מאפיינים ביומכנית מכובדים, למשל, תכונת דעיכה, גודל נקבובי, קיבולת טעינה ואמינה 7. במטרה לבחון את biocompatibility של שתל גרעין הרומן הזה, מתואר מגבלות חמורות בטכניקות הניתוח (האופטיות) מיוחס האופי הלא-השקוף של השתל.
על מנת לבדוק את ההתאמה הביולוגית, אינטראקצית תא-מתכת ממלאת תפקיד בולט 8-10. אינטראקציה בין תאי הפיגום הכרחית לייצוב ומכאן לשילוב השתל הטוב יותר בתוך המערכת המארחת. עם זאת, עומק ingrowth הגדלה עשוי לשנות את התכונות המכאניות של הפיגום. במטרה investigate אם פני שטח הפיגום מספקים בסיס מצורף תא, התפשטות והבחנה או אם המתכת משפיעה על כדאיויות תא, חשוב לפתור את הבעיה הנפוצה הידועה של תאי הדמיה על / פיגומים שאינם שקופים ואטומים. על מנת להתגבר על ניאון כמה מגבלה זו טכניקות המבוססות נחקרו. חברות לספק מגוון רחב של fluorophores לדמיין תאי חיים, תאים סלולריים, או אפילו מדינות הסלולר ספציפיות 11. Fluorophores לניסוי זה נבחר בעזרת צופה ספקטרלי הכלי המקוון כדי טוב ביותר כדי להתאים מיקרוסקופ פלואורסצנטי שלנו.
האסטרטגיה שפותחה עבור הניתוח של התנהגות תאים החסידה על / בתוך פיגום טיטניום סרוג הלא שקוף כרוך הבא: פלורסנט 1) (חלבון פלואורסצנטי ירוק / GFP) התיוג של תאי osteochondro-האב לאפשר מעקב אחר התאים על פיגום, 2) מדידת כדאיות (Mitoפעילות chondrial) של התאים, ו -3) תאי תאי הדמית אינטראקציות חומר תאים בתוך הפיגום. ההליך יש את היתרון שהוא יכול בקלות להיות מועבר תאים חסידים אחרים פיגום שאינו שקוף או אטום אחר. יתר על כן, הכדאיות דפוס ingrowth ניתן לנטר על פני כמה ימים, ולכן ניתן להשתמש בו עם כמויות מוגבלות של פיגום חומר או תאים.
המחקר הנוכחי מדגים את השימוש המוצלח של הפרוטוקול הנוכחי, כדי לאמוד את כדאיות התא ולדמיין צמיחה דפוס של תאים osteochondro-אב על / בתוך הפיגום טיטניום סרוגים שאינם שקופים. יתר על כן, פרוטוקולים שפותחו עשויים לשמש על מנת לקבוע את זיהומי הפיגום לבדוק פרוטוקולי ניקוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
משטח הפיגום ממלא תפקיד חשוב באינטראקציה שלו עם רקמה סובבת in vivo ובכך לקבוע שתלים עמידים פונקציונלי. לפיכך, התאימות ביו של הפיגום היא למדה על ידי מבחנים במבחנה באמצעות תאים (קו תא SCP1), כאשר מצופים על הפיגומים.
שיטות מיקרוסק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט ממומן בחלקו על ידי Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (צים) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. דמי הפרסום כבר מכוסה על ידי בית החולים טראומה BG טובינגן, גרמניה.
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What’s new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Buck, A. E., Kaps, H. -. P. Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. . Optical Techniques in Regenerative Medicine. , (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- . Thermofisher Fluorescence Spectraviewer Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016)
