Imaging celleviabilitet på ugjennomsiktige Stillas - Bruke Eksempel på en roman Strikket Titanium Implant
Summary
Her presenterer vi en fluorofor basert avbildningsteknikk for å detektere cellenes levedyktighet på en ikke-transparent titan stillaset, så vel som å detektere glimt av stillasurenheter. Denne protokollen feilsøker den ulempe avbildning celle-celle eller celle-interaksjoner metall på ikke-transparente stillasene.
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
Kroniske ryggsmerter er en multifaktoriell sykdom. Interessen for en minimal invasiv behandling for degenerative plate sykdom har vokst siden 1950. Frem til i dag, multisegment fusjon av ryggsøylen er den mest brukte behandling. Siden denne metoden ofte fører til begrensninger i mobiliteten av det berørte segmentet 1,2, utforskning av protesetiden ble en bred interesse. Betydelige fremskritt i total plate erstatning og kjernen erstatning har blitt et godt alternativ til å behandle kroniske ryggsmerter en. Til tross for store fremskritt, har ingen av metodene er klinisk evaluert. De mindre stive nucleus implantater representerer et lovende alternativ til total plate erstatning, forutsatt at ringrommet fibrosus er intakt 3,4. Imidlertid er de for tiden foreliggende nukleus implantater på markedet ofte forbundet med komplikasjoner som forandringer i vertebrale legeme, forvridning, vertikal høyde tap av skiven og than mangel på nødvendige tilhørende mekanisk stivhet 5. For å overvinne de gjeldende ulempene, har en ny kjerne implantat fremstilt av titan strikkede tråder blitt utviklet 6. På grunn av den unike strikket struktur, har denne nyutviklede stillas vist særpregede biomekaniske egenskaper, for eksempel demping funksjon, pore størrelse, lastekapasitet og pålitelighet 7. Tar sikte på å teste biokompatibilitet av denne nye kjernen implantat, avbildet store begrensninger i (optisk) analyseteknikker tilskrives den ikke-transparente natur av implantatet.
For å teste den biokompatibilitet, spiller celle-metall interaksjon en fremtredende rolle 8-10. En interaksjon mellom cellene og stillaset er nødvendig for stabilisering og dermed til bedre implantatet integrering i vertssystemet. Imidlertid kan en økende innvekst dybde forandre de mekaniske egenskaper for stillaset. Sikte på å investigate om stillas overflaten gir et utgangspunkt for celleadhesjon, proliferasjon og differensiering, eller hvorvidt metallet påvirker cellenes levedyktighet, er det viktig å feilsøke den vanlige velkjente problemet med å avbilde celler på / i ikke-transparente og opake stillaser. For å overvinne denne begrensningen flere fluorescerende baserte teknikker ble utforsket. Selskaper tilbyr et stort utvalg av fluorophores å visualisere levende celler, cellular avdelinger, eller til spesifikke cellulære tilstander 11. Fluoroforer for dette eksperimentet ble valgt ved hjelp av den elektroniske verktøyet spektral viewer for å best passe vår fluorescerende mikroskop.
Den utviklede strategi for analyse av adherente celler oppførsel på / i det ikke-gjennomsiktige strikket titan stillaset omfatter følgende: 1) fluoriserende (green fluorescent protein / GFP) merking av de osteochondro-forløperceller til å tillate sporing av cellene på stillas, 2) måle levedyktighet (mitochondrial aktivitet) av cellene, og 3) å visualisere celle-celle og celle-materiale interaksjoner i stillaset. Fremgangsmåten har den fordel at det lett kan overføres til andre adherente celler og andre ikke-transparent eller ugjennomsiktig stillaset. Videre kan levedyktighet og innvekst mønster overvåkes i løpet av flere dager, slik at det kan anvendes med begrensede mengder av stillasmateriale eller celler.
Den foreliggende studien viser vellykket bruk av vår nåværende protokoll for å måle cellenes levedyktighet og visualisere i-vekstmønster av osteochondro-progenitorceller på / i det ikke-gjennomsiktige strikket titan stillaset. Videre kan de industrialiserte protokoller brukes for å bestemme de stillasurenheter og for å kontrollere renseprotokoller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stillaset flate spiller en viktig rolle i dets interaksjon med omkringliggende vev in vivo for derved å bestemme implantater funksjonell holdbarhet. Således er bio-forenlighet av stillaset studert ved in vitro-analyser ved anvendelse av celler (SCP1 cellelinje), når belagt på stillasene.
Mikroskopi teknikker som fungerer godt med tynne og optisk transparente stillaser er dårlig egnet for ikke-gjennomsiktige stillasene for å studere biokompatibilitet. Dette er hovedsak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prosjektet er delvis finansiert av Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. Publikasjonen avgiften er omfattet av BG traumer sykehuset Tübingen, Tyskland.
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What’s new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Buck, A. E., Kaps, H. -. P. Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. . Optical Techniques in Regenerative Medicine. , (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- . Thermofisher Fluorescence Spectraviewer Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016)
