Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

Summary

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Abstract

Zoals met kleinmoleculige geneesmiddelen, screenen op peptide agonisten vereist seriële verdunning van peptiden naar concentratie-respons curves produceren. Screening peptiden biedt een extra complexiteit conventionele tip gebaseerde steekproef behandelingsmethoden peptiden blootstellen aan een groot oppervlak van plasticware, die een verhoogde kans peptide verlies via adsorptie. Waardoor een overmatige blootstelling aan plasticware peptide vermindert verlies via hechting aan kunststoffen en dus minimaliseert onnauwkeurigheden in potentie voorspelling, en we hebben eerder beschreven voordelen van contactloze akoestische afgifte in vitro high-throughput screening van peptide agonisten ^1. Hier bespreken we een volledig geïntegreerde automatiseringsoplossing voor contactloze akoestische bereiding van peptide seriële verdunningen in microtiterplaten met gebruikmaking van het voorbeeld voor het screenen op peptide agonisten bij de muis glucagon-achtige peptide-1 receptor (GLP-1R). Onze methoden zorgen voor een hoge-throughput cell-based assays voor het screenen op agonisten en zijn gemakkelijk schaalbaar naar grotere monsters worden verwerkt ondersteunen of te zorgen voor een verhoogd aantal testplaat kopieën (bijvoorbeeld voor een panel van meer doel cellijnen).

Introduction

De GLP-1R is een gevestigde drug target in de behandeling van type 2 diabetes ^2. Het natieve peptide agonist voor deze receptor, GLP-1 heeft een in vivo halfwaardetijd van 2-3 minuten ^3. De binding van GLP-1 zijn G-eiwit gekoppelde receptor leidt tot doel de verwerking tot de tweede boodschapper cAMP met natief G-proteïne koppeling aan de activering van adenylylcyclase. Meting van de geaccumuleerde cAMP werd een degelijke test om receptoractivering controleren en te screenen op actieve GLP-1 analoga met voorkeur fysicochemische eigenschappen. Een dergelijke bepaling vereist seriële verdunning van de monsters concentratie-respons curves construeren, en dit is bijzonder moeilijk bij de afgifte van peptide monsters. Mogelijke fouten uit-tip op basis van seriële verdunning voorbereiding zijn eerder ^1,4,5 beschreven. Peptiden zullen adsorberen aan plasticware, wat resulteert in onbetrouwbare potentie schattingen. Peptide verlies kan worden geminimaliseerd dezhij opneming van runderserumalbumine (BSA) in buffers en het gebruik van silicium voorziene plasticware, maar blijft de eiwitbinding onvoorspelbaar. Met name de variatie in binding van GLP-1 experimentele containers beschreven ^6. Er is een bijkomende complicatie, dat stabilisatiemiddelen gebruikt in laboratoria plasticware kunnen uitlogen van tips en microtiterplaten in waterige assay buffers en interfereren met eiwitfunctie ^{7, 8.} Daarom methoden om blootstelling aan plasticware nodig om de nauwkeurigheid van de metingen te verbeteren.

Akoestische vloeistof dispensers richten hoogfrequente akoestische signaal op het oppervlak van een vloeistofmonster, waardoor het uitstoten van precieze nanoliter druppeltjes in een aangrenzende testplaat ^9. Het gebruik van akoestische ejectie is standaard in de farmaceutische industrie voor de voorbereiding en screening van grote synthetische verbinding bibliotheken, en de technologie is goed gevalideerd voor kleine molecules ^10. Voor zover wij weten, zijn wij de eerste groep van akoestische afgifte beschrijven de bereiding van recombinant en synthetische peptiden en we hebben eerder gemeld de verbeterde nauwkeurigheid in vergelijking met conventionele tip gebaseerde methoden ^1.

Dit artikel beschrijft de integratie van de voorbereiding van de peptide seriële en directe verdunningen van non-contact akoestische overgang naar een volledig geautomatiseerde plaat omgaan met robotica-systeem. Een aantal werkwijzen omvattende akoestische monsteroverdracht zijn eerder ¹¹ beschreven. We gebruiken een tweestapswerkwijze tussenliggende stock concentraties bereiden en serieel verdund peptide analogen voor de vorming van de volledige dosis-responscurve. De bereide peptiden worden geïncubeerd met cellen die het doelwit muis GLP-1R, en we gebruiken een commercieel verkrijgbare homogene-time fluorescentie (HTRF) test om cAMP ophoping binnen deze cellen te meten als een uitlezing van de peptide-agonist activteit. De test is robuust en vatbaar voor een hoge doorvoer 384 putjes en routinematig toegepast op zowel assay ontwikkeling en het screenen van geneesmiddelen ¹² projecteert.

Protocol

1. Peptide seriële verdunning Bereid testbuffer: Hanks gebufferde zoutoplossing (HBSS), aangevuld met 25 mM HEPES, 0,1% BSA en 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), pH 7,4. Gebruik een bulk reagens dispenser systematisch toe 5 pl testbuffer aan elk putje van 384 putjes vijf low volume testplaten. Gebruik interne software om een ​​afgifte programma creëren 5 ul volume toevoeging aan elk putje van een 384-putjes volgens de instructies van de fabrikant. Dompel het afgeven …

Representative Results

We routinematig gebruik van een twee-staps methode om peptiden te verdunnen via akoestische overdracht. Voor de eerste stap, wordt een akoestische dispenser afgestemd automatisering gebruikt vier stock peptide tussenliggende verdunningen over twee bronplaten maken (figuur 1a, b). Voor de tweede stap, gebruiken we een akoestische dispenser verder verdunnen stock verdunningen van bronplaten A en B een 11-punts concentratiebereik voor elke test peptid…

Discussion

Dit protocol beschrijft de succesvolle toepassing van geautomatiseerde akoestische afgifte aan peptide monsters serieel verdunnen over een concentratiegebied van 3 x 10 ⁶ die minder dan 1 pl monster. Het grote voordeel van deze methode is de gegevenskwaliteit verhogen door het minimaliseren peptide adsorptie aan plasticware via verminderde blootstelling monsters experimentele containers en plasticware (zoals pipetpunten) die normaal voor reagensoverdracht en mengen vereist. Terwijl de akoestische afgifte niet…

Materials

Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100X peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer