効力決意アッセイにおけるペプチドアゴニストの連続希釈のために調剤自動アコースティック
Summary
Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.
Abstract
小分子薬物の発見と同様に、ペプチドアゴニストのスクリーニングは、濃度 – 応答曲線を生成するために、ペプチドの連続希釈を必要とします。ペプチドをスクリーニングすることは、従来のチップベースのサンプル処理方法は、吸着を介してペプチド損失の増加の機会を提供し、プラスチック容器の大きな表面積にペプチドを露出させるように複雑さの付加的な層が得られます。プラスチック容器への過度の露出を防止するには、プラスチックへの付着を介してペプチドの損失を低減し、したがって効力予測において不正確さを最小限にし、我々は、以前にペプチドアゴニスト1のin vitroでのハイスループットスクリーニングのために分配する非接触音響の利点を記載しています。ここでは、マウスのグルカゴン様ペプチド1受容体（GLP-1R）にペプチドアゴニストのスクリーニングの例を利用してマイクロタイタープレート中のペプチドの連続希釈の非接触音響の調製のための完全に統合された自動化ソリューションを議論します。私たちの方法は、高を可能にアゴニストをスクリーニングするための細胞ベースのアッセイ-throughputおよび増加サンプルスループットをサポートするために、または（複数の標的細胞株のパネルのために、例えば 、）をアッセイプレートのコピー数の増加を可能にするために容易に拡張可能です。
Introduction
GLP-1Rは、2型糖尿病2の治療において確立された薬物標的です。この受容体に対する天然ペプチドアゴニストは、GLP-1は、2〜3分のインビボ半減期を有します。アデニリルシクラーゼの活性化に対する天然のGタンパク質結合を介して二次メッセンジャーcAMPの下流の製造におけるそのGタンパク質共役標的受容体の結果をGLP-1の結合。蓄積されたcAMPの測定は、受容体活性化を監視するため、好ましい物理化学的特性を有する活性GLP-1類似体をスクリーニングするための堅牢なアッセイを提供します。このようなアッセイは、濃度応答曲線を構築するために、試験試料の連続希釈を必要とし、ペプチドのサンプルを渡すときに、これは特に複雑です。チップベースのシリアル希釈調製物からの潜在的なエラーは、以前1,4,5に記載されています。ペプチドは、信頼性の低い効力の推定の結果、プラスチック容器に吸着します。ペプチドの損失は、Tを介して最小化することができます彼の緩衝液中のウシ血清アルブミン（BSA）を含めると、シリコン処理プラスチック製品の使用、まだタンパク質結合が予測できないまま。具体的には、実験的なコンテナにGLP-1の結合の変化が6に記載されています。実験室用プラスチック製品で使用されている安定剤のさらなる合併症が水性アッセイ緩衝液中に先端およびマイクロタイタープレートから浸出し、タンパク質機能7,8を妨害する可能性がある。したがって、プラスチック容器への曝露を低減するための方法は、測定の精度を高めるために必要です。
音響液体ディスペンサは、隣接するアッセイプレート9に正確なナノリットル液滴の吐出が得られ、流体試料の表面に高周波音響信号をフォーカス。音響放出の使用は、大規模な合成化合物ライブラリーの調製およびスクリーニングのための製薬業界の標準であり、技術は十分に小さいmoleculのために検証されていますエス10。我々の知る限り、我々は、組換えおよび合成ペプチドの製造のための音響分与を記述するための最初のグループであり、私たちは以前に、従来のチップベースの方法1に比べて改善された精度を報告しています。
この記事では、完全に自動化されたプレートハンドリングロボットシステムに非接触音響伝達によるペプチドシリアルおよび直接希釈液の準備の統合について説明します。サンプルの音響伝達を包含する多数の方法は、以前11に記載されています。我々は、中間ストック濃度を調製し、連続完全な用量反応曲線を生成するためのペプチド類似体を希釈するために、二段階法を利用します。準備されたペプチドは、ターゲットのマウスGLP-1Rを発現する細胞とインキュベートし、そして我々は、ペプチドアゴニストACTIVの読み出しとして、これらの細胞内cAMP蓄積を測定するための市販の均一時間分解蛍光（HTRF）アッセイを使用しています性。アッセイは、ハイスループット384ウェル形式に堅牢で適していると12を投影日常的アッセイ開発及び薬物スクリーニングの両方に適用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、シリアルサンプルの1未満μLを必要とする3×10 6の濃度範囲にわたってペプチド試料を希釈するための自動化された音響ディスペンシングの成功のアプリケーションについて説明します。この方法の主な利点は、通常は、試薬移送および混合のために必要とされている（例えば、ピペットチップなど）、実験容器プラスチック容器への試料の還元暴露を介してプラス…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100X peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
References
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