Automatisert Acoustic Doserings for serie Fortynning av Peptide agonister i Potens Fastsettelse Analyser

Summary

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Abstract

Som med lite molekyl drug discovery, screening for peptid-agonister krever seriefortynning av peptider for å produsere konsentrasjons-responskurvene. Screening peptider gir et ekstra lag av kompleksitet som konvensjonelle tip-baserte metoder for prøvehåndtering utsette peptider til et stort overflateareal på plasticware, noe som gir en øket mulighet for peptid tap via adsorpsjon. Forebygging av overdreven eksponering for plasticware reduserer peptid tap via tilslutning til plast og dermed reduserer unøyaktigheter i potens prediksjon, og vi har tidligere beskrevet fordelene av ikke-kontakt akustisk dispensering for in vitro high-throughput screening av peptid-agonister ^1. Her diskuterer vi et fullt integrert automatisering løsning for ikke-kontakt akustiske fremstillingen av peptid seriefortynninger i mikrotiterplater ved anvendelse av eksempel på screening for peptid-agonister til mus glukagon-lignende peptid-1-reseptoren (GLP-1R). Våre metoder gir mulighet for høy-throughput celle-baserte analyser til skjermen for agonister og er lett skalerbar å støtte økt prøvekapasitet, eller å tillate økt antall analyseplate kopier (f.eks, for et panel bestående av flere mål cellelinjer).

Introduction

GLP-1R er en etablert medikamentmål i behandlingen av type 2 diabetes ^to. Det native peptid agonist for denne reseptoren, GLP-1, har en in vivo halveringstid på 2-3 min ^3. Bindingen av GLP-1 til dens G-protein koblet reseptor mål resultater i nedstrøms produksjon av den andre budbringer cAMP gjennom naturlig G-protein kopling til aktivering av adenylat cyclase. Måling av akkumulert cAMP gir en robust analyse for å overvåke reseptor aktivering og til skjermen for aktive GLP-1-analoger med foretrukne fysisk-kjemiske egenskaper. Et slikt assay krever seriefortynning av testprøver for å konstruere konsentrasjons-responskurvene, og dette er særlig komplisert når levere peptid prøver. Potensielle feil fra tip-basert seriell fortynning forberedelse har blitt beskrevet tidligere ^1,4,5. Peptider vil adsorberes til plasticware, noe som resulterer i upålitelige potens estimater. Peptide tap kan minimeres gjennom than inkludering av bovint serumalbumin (BSA) i buffere og bruk av silikonisert plasticware, men proteinbindings fortsatt uforutsigbart. Spesielt er variasjonen i binding til GLP-1 for å eksperimentelle beholderne er beskrevet ^6. Det er en ytterligere komplikasjon ved at stabiliseringsmidler som anvendes i laboratoriet plasticware kan lekke fra tips og mikrotiterplater i vandig assay-buffere og interferere med proteinfunksjon ^{7, 8.} Derfor er fremgangsmåter for å redusere eksponeringen til plasticware er nødvendig for å øke nøyaktigheten av målingene.

Akustiske flytende dispensere fokusere et høyfrekvent akustisk signal på overflaten av en fluidprøve, noe som resulterer i utstøting av presise nanoliter dråper inn i en tilstøtende analyseplate ^9. Bruken av akustiske utstøting er standard i den farmasøytiske industrien for utarbeidelse og screening av store syntetiske sammensatte bibliotekene, og teknologien har vært godt validert for liten molecules ^10. Så vidt vi vet er vi den første gruppen til å beskrive akustiske levering for utarbeidelse av rekombinante og syntetiske peptider, og vi har tidligere rapportert forbedret nøyaktighet i forhold til konvensjonelle tip-baserte metoder ^1.

Denne artikkelen beskriver integrering av fremstillingen av peptid serielle fortynninger og direkte ved ikke-kontakt akustisk overføring på en fullt ut automatisert håndtering av plate robotsystem. En rekke fremgangsmåter som omfatter akustisk overføring av prøver er blitt beskrevet tidligere ^11. Vi benytter en to-trinns metode for å fremstille mellomliggende lager konsentrasjoner og for å serielt fortynnet peptidanaloger for generering av full dose-responskurve. De fremstilte peptider blir inkubert med celler som uttrykker en mål-mus GLP-1R, og vi benytter en kommersielt tilgjengelig homogen tidsoppløst fluorescens (HTRF) assay for å måle cAMP-akkumulering i disse cellene som en avlesning av peptid-agonist Activligheten. Analysen er robust og mottagelig for en high-throughput 384-brønners format og rutinemessig brukt til både analysen utvikling og medikamentscreening rager ^12.

Protocol

1. Peptide Serial fortynning Fremstille analysebuffer: Hanks bufret saltoppløsning (HBSS) supplementert med 25 mM HEPES, 0,1% BSA og 0,5 mM 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), pH 7,4. Bruke en bulk reagentutdeler for systematisk å legge til 5 pl av analysebuffer til hver brønn av fem 384-brønners lavt volum analyseplater. Bruk intern programvare for å lage en doseringsprogram for 5 mL volum tillegg til hver brønn i en 384-brønners plate i henhold til produsentens anvisninger. …

Representative Results

Vi benytter rutinemessig en to-trinns metode for å fortynne peptider via akustisk overføring. For det første trinnet, blir en akustisk dispenser innrettet med automatisering brukes til å lage fire lager peptid-mellom fortynninger over to kildeplater (figur 1a, b). For det andre trinnet, bruker vi en akustisk dispenser for ytterligere å fortynne lager fortynninger fra kilde platene A og B for å skape et 11-punkts konsentrasjonsområde for hver…

Discussion

Denne protokollen beskriver den vellykkede anvendelse av automatiserte akustisk utleverings til serielt fortynnede peptid prøver over et konsentrasjonsområde på 3 x 10 ^{til 6} krever mindre enn 1 ul prøve. Den store fordelen med denne fremgangsmåten er å øke datakvaliteten gjennom minimere peptid adsorpsjon til plasticware via redusert eksponering av prøvene for å eksperimentelle beholdere og plasticware (for eksempel pipettespisser) som normalt kreves for reagens overføring og blanding. Mens akustisk…

Materials

Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100X peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer