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Immunology and Infection

फ्लोरोसेंट रंजक के साथ एंटीबॉडी लेबलिंग चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी मोतियों का उपयोग

Published: September 15, 2016 doi: 10.3791/54545
Automatic Translation
1, 1, 1
1Promega Corporation

Summary

छोटे अणुओं के साथ एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए ऑन-मनका विधि सेल मीडिया से सीधे एंटीबॉडी की एक छोटी राशि की लेबलिंग में सक्षम बनाता है। इस विधि अमाइन और thiol रसायन विज्ञान के साथ संगत है, और मैन्युअल रूप से या स्वचालित प्लेटफार्मों का उपयोग समानांतर में कई नमूने, संभाल कर सकते हैं।

Abstract

फ्लोरोसेंट रंजक, साइटोटोक्सिक दवाओं, और रेडियोधर्मी ट्रेसर जैसे छोटे अणुओं के साथ लेबल एंटीबॉडी चिकित्सीय एजेंट जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में आवश्यक उपकरण, immunodiagnostics और अधिक हाल ही के रूप में कर रहे हैं। छोटे अणुओं के साथ लेबलिंग एंटीबॉडी के लिए पारंपरिक तरीकों अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता में शुद्ध की आवश्यकता होती है एंटीबॉडी, कई डायलिसिस कदम शामिल और throughput सीमित है। हालांकि, एंटीबॉडी ड्रग conjugates (एडीसी) के क्षेत्र सहित कई अनुप्रयोगों, नए तरीकों कि एंटीबॉडी की लेबलिंग सेल मीडिया से सीधे अनुमति देगा से लाभ होगा। , एडीसी के मामले में रिसेप्टर की मध्यस्थता एंटीबॉडी internalization परख इस तरह के तरीकों एंटीबॉडी, जैविक रूप से प्रासंगिक assays में जांच की जा करने के लिए उदाहरण के लिए अनुमति दे सकता। यहाँ, हम एक विधि (ऑन-मनका विधि) कि सेल मीडिया से सीधे एंटीबॉडी की छोटी मात्रा की लेबलिंग के लिए सक्षम बनाता का वर्णन है। यह दृष्टिकोण एंटीबॉडी पर कब्जा करने के लिए उच्च क्षमता चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी आत्मीयता के मोतियों का इस्तेमालया तो अमाइन या thiol रसायन शास्त्र और लेबल एंटीबॉडी के बाद क्षालन का उपयोग कर छोटे अणुओं के साथ लेबलिंग के द्वारा पीछा सेल मीडिया से। छोटे अणुओं के लिए सरोगेट मदर के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों ले रहा है, हम दोनों अमाइन और thiol लेबलिंग रसायन विज्ञान का उपयोग सेल मीडिया से सीधे तीन अलग-अलग माउस एंटीबॉडी के ऑन-मनका लेबलिंग प्रदर्शित करता है। एक प्रोटीन और प्रोटीन जी के लिए एंटीबॉडी के उच्च बंधन आत्मीयता उच्च वसूली के रूप में अच्छी तरह के रूप में लेबल एंटीबॉडी के उच्च शुद्धता सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, चुंबकीय मोती के उपयोग के कई नमूने जिससे काफी लेबलिंग throughput में सुधार मैन्युअल नियंत्रित किया जा करने के लिए, की अनुमति देता है।

Introduction

छोटे अणुओं के साथ लेबल एंटीबॉडी शायद जीव विज्ञान 1,2 में सबसे अधिक इस्तेमाल किया अभिकर्मकों हैं। फ्लोरोसेंट रंगों और बायोटिन के साथ लेबल एंटीबॉडी बड़े पैमाने पर इमेजिंग, immunoassays में इस्तेमाल कर रहे हैं, अन्य अनुप्रयोगों 3-6 के बीच प्रवाह cytometry, पश्चिमी blots, और immunoprecipitation। Radiolabeled एंटीबॉडी 3,7 के कैंसर के इलाज के लिए नए विकल्प की पेशकश कर रहे हैं, और दो ​​एडीसी को पहले से ही चिकित्सकीय प्रयोग 8 के लिए अनुमोदित किया गया है इमेजिंग और चिकित्सा, साइटोटोक्सिक दवाओं (एडीसी) के साथ लेबल एंटीबॉडी में व्यापक उपयोग पाते हैं। उनके व्यापक उपयोग के बावजूद, लेबलिंग एंटीबॉडी के लिए तरीकों आश्चर्यजनक रूप से अपरिवर्तित बनी हुई है और आम तौर पर कई प्रतिक्रियाओं शामिल है और desalting कदम 9-12। समाधान के तरीकों मामलों में जहां केवल कुछ एंटीबॉडी लेबल किया जा करने की जरूरत है और उच्च एकाग्रता में अत्यधिक शुद्ध रूप में उपलब्ध हैं और पर्याप्त मात्रा में बहुत अच्छी तरह से काम करते हैं। एक हालांकि, एडीसी जैसे नए अनुप्रयोगों के लिए, वहाँ हैप्रारंभिक चरण में हाइब्रिडोमा एंटीबॉडी लेबल करने के लिए इतना है कि वे, जैविक रूप से प्रासंगिक गुण के लिए जांच की जा सकती है उदाहरण के लिए, रिसेप्टर की मध्यस्थता एंटीबॉडी internalization 13-16 के लिए की जरूरत है। हाइब्रिडोमा स्तर पर, नमूना मात्रा सीमित कर रहे हैं, एंटीबॉडी कम मात्रा में व्यक्त कर रहे हैं और नमूने के एक नंबर के बड़े हैं, इसलिए समाधान आधारित लेबलिंग तरीकों उपयुक्त नहीं हैं।

सरल और पारंपरिक तरीकों एंटीबॉडी लेबलिंग के throughput में सुधार करने के लिए, कुछ वैकल्पिक तरीकों 17,18 प्रस्तावित किया गया है। एक दृष्टिकोण गैर चुंबकीय एक प्रोटीन आत्मीयता के मोती छोटे स्तंभों में पैक का उपयोग करने के लिए लेबलिंग प्रतिक्रिया और लेबल और शुद्ध प्रोटीन की क्षालन द्वारा पीछा किया एंटीबॉडी कब्जा है। इस विधि सेल मीडिया से सीधे एंटीबॉडी लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, स्तंभों के उपयोग श्रमसाध्य हो सकता है। एक चुंबकीय मनका आधारित पद्धति हाल ही में 19 बताया गया है कि स्तंभों का उपयोग समाप्त और throughput लेकिन कारण में सुधारसीमित एंटीबॉडी बाध्यकारी मोतियों की क्षमता है, केवल एंटीबॉडी का कम माइक्रोग्राम मात्रा को nanogram लेबल किया जा सकता है।

हमने हाल ही में विकसित की है और उच्च क्षमता चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी मोती (> मानव आईजीजी / बसे मोतियों की मिलीलीटर की 20 मिलीग्राम) छोटे अणुओं 20 के साथ सेल मीडिया में उपस्थित एंटीबॉडी लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया। मोतियों की उच्च क्षमता एंटीबॉडी की माइक्रोग्राम की सैकड़ों करने के लिए दसियों आसानी से लेबल किया जा अनुमति देता है और मोतियों की तेजी चुंबकीय प्रतिक्रिया हैंडलिंग और समानांतर में नमूने की एक बड़ी संख्या के प्रसंस्करण सरल करता है। छोटे अणुओं के लिए सरोगेट मदर के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कर, हम बताते हैं कि विधि अमाइन और thiol लेबलिंग रसायन विज्ञान के साथ संगत है और लेबल और बहुत शुद्ध एंटीबॉडी के उच्च वसूलियां प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल और साथ वीडियो चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी मोतियों का उपयोग सेल मीडिया में मौजूद माउस एंटीबॉडी के ऑन-मनका लेबलिंग का वर्णन है। प्रोटोकॉल हैचार वर्गों में बांटा गया है: धारा 1 जैविक नमूने से मनका पर एंटीबॉडी का कब्जा वर्णन करता है। कब्जे के बाद, अमाइन रसायन विज्ञान का उपयोग कर या thiol रसायन विज्ञान का उपयोग फ्लोरोसेंट डाई के साथ एंटीबॉडी की लेबलिंग धारा 2 और 3 खंड में वर्णन किया गया है, क्रमशः। अंत में, धारा 4 एंटीबॉडी एकाग्रता की गणना और एंटीबॉडी के अनुपात करने के लिए डाई के लिए विधि का वर्णन है।

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Protocol

1. उच्च क्षमता चुंबकीय एक प्रोटीन या चुंबकीय प्रोटीन जी मोती पर कब्जा एंटीबॉडी

  1. कोमल झटकों से चुंबकीय मोती समान रूप से फिर से निलंबित। जब मोती aliquoting निलंबन वर्दी रखें।
  2. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब मनका घोल के 50 μl जोड़ें। 10 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड में रखें। ध्यान से भंडारण बफर हटा दें।
  3. एंटीबॉडी बाध्यकारी बफर के 250 μl जोड़ें।
  4. मिक्स और 10 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड में जगह है। ध्यान से बाध्यकारी बफर हटा दें।
  5. मोती के लिए एंटीबॉडी के 50-100 माइक्रोग्राम युक्त नमूने के 1.0 मिलीलीटर जोड़ें। नमूने सेल मीडिया में एंटीबॉडी या एंटीबॉडी शुद्ध किया जा सकता है।
  6. आरटी पर 60 मिनट के लिए नमूना मिक्स एक भंवर मिक्सर या अंत से अधिक अंत मिक्सर का उपयोग।
  7. 10 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब प्लेस और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  8. एंटीबॉडी बाध्यकारी / वाशिंग बफर के 250 μl और मिश्रण जोड़ें। चुंबकीय स्टैंड में 10 सेकंड के लिए जगह है और बाध्यकारी / वाशिंग बफर हटा दें। इस क्रिया को एसदो washes के एक कुल के लिए TEP।
  9. अमाइन रसायन शास्त्र या धारा 3 के लिए thiol रसायन विज्ञान का उपयोग लेबल एंटीबॉडी के लिए उपयोग कर लेबल एंटीबॉडी के लिए धारा 2 के लिए आगे बढ़ें।

2. एंटीबॉडी लेबलिंग अमाइन रसायन विज्ञान का उपयोग

  1. साधना एंटीबॉडी
    1. मोती के लिए अमाइन विकार बफर के 100 μl जोड़ें।
    2. डाई की 1.0 मिलीग्राम डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के 100 μl जोड़कर 10 मिलीग्राम / एमएल पर एमाइन प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट रंजक (AlexaFluor 532-एसई) भंग। vortexing द्वारा मिक्स। बस का उपयोग करने से पहले यह समाधान करें।
    3. एंटीबॉडी के 100 माइक्रोग्राम के लिए एमाइन प्रतिक्रियाशील डाई के 2.5 μl जोड़ें।
      नोट: आमतौर पर प्रतिक्रियाशील डाई की एक 5-20 दाढ़ अतिरिक्त सिफारिश की है। हालांकि, प्रतिक्रियाशील डाई की राशि जोड़ा की प्रतिक्रिया अनुभव से एंटीबॉडी अनुपात और आंतरिक एंटीबॉडी गुण करने के लिए वांछित डाई के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    4. आरटी पर 60 मिनट के लिए नमूना मिक्स एक भंवर मिक्सर या अंत से अधिक अंत मिक्सर का उपयोग। सुनिश्चित करें कि मोती suspensio में रहते हैंएन।
    5. 10 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब प्लेस और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    6. एंटीबॉडी बाध्यकारी / वाशिंग बफर के 250 μl और मिश्रण जोड़ें। 10 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड में रखें। निकालें और बाध्यकारी / वाशिंग बफर त्यागें। दो washes के एक कुल के लिए इस चरण को दोहराएँ।
  2. एंटीबॉडी वसूली
    1. मोती के लिए क्षालन बफर के 50 μl जोड़ें।
    2. आरटी पर 5 मिनट के लिए मिश्रण एक भंवर मिक्सर या अंत से अधिक अंत मिक्सर का उपयोग। सुनिश्चित करें कि मोती निलंबन में रहते हैं।
    3. 10 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब रखें। एक नया सूक्ष्म अपकेंद्रित्र निराकरण बफर के 5 μl युक्त ट्यूब eluted नमूना और हस्तांतरण निकालें।
    4. प्रक्रिया एक बार और दोहराएँ और eluted नमूने पूल।
    5. एंटीबॉडी एकाग्रता quantitate और डाई करने वाली एंटीबॉडी अनुपात धारा 4 में वर्णित है।

3. एंटीबॉडी लेबलिंग thiol रसायन विज्ञान का उपयोग

  1. एंटीबॉडी कमी
    1. 250 μl जोड़ेthiol विकार बफर और मिश्रण की। 10 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब रखें। निकालें और बफर त्यागें। इस कदम दो बार दोहराएँ।
    2. thiol विकार बफर के 100 μl जोड़ें।
    3. Dithiothreitol (डीटीटी) 2.5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें।
    4. आरटी पर 60 मिनट के लिए नमूना मिक्स एक भंवर मिक्सर या अंत से अधिक अंत मिक्सर का उपयोग। सुनिश्चित करें कि मोती निलंबन में रहते हैं।
    5. 10 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब प्लेस और बफर त्यागें।
    6. thiol विकार बफर के 250 μl और मिश्रण जोड़ें। 10 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब रखें। निकालें और बफर त्यागें। दो washes के एक कुल के लिए इस चरण को दोहराएँ।
    7. thiol विकार बफर के 100 μl जोड़ें।
  2. साधना एंटीबॉडी
    1. डाई की 1.0 मिलीग्राम DMSO के 100 μl जोड़कर / एमएल 10 मिलीग्राम पर thiol प्रतिक्रियाशील डाई भंग। vortexing द्वारा मिक्स। बस का उपयोग करने से पहले यह समाधान करें।
    2. विरोधी के 100 माइक्रोग्राम के लिए thiol प्रतिक्रियाशील डाई के 2.5 μl जोड़ेतन।
      नोट: आमतौर पर प्रतिक्रियाशील डाई की एक 5-20 दाढ़ अतिरिक्त सिफारिश की है। हालांकि, प्रतिक्रियाशील डाई की राशि जोड़ा की प्रतिक्रिया अनुभव से एंटीबॉडी अनुपात और आंतरिक एंटीबॉडी गुण करने के लिए वांछित डाई के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    3. आरटी पर 60 मिनट के लिए नमूना मिक्स एक भंवर मिक्सर या अंत से अधिक अंत मिक्सर का उपयोग। सुनिश्चित करें कि मोती निलंबन में रहते हैं।
    4. 10 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब प्लेस और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    5. thiol विकार बफर के 250 μl और मिश्रण जोड़ें। 10 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड में रखें और बफर हटा दें। दो washes के एक कुल के लिए इस चरण को दोहराएँ।
  3. Elute एंटीबॉडी
    1. मोती के लिए क्षालन बफर के 50 μl जोड़ें।
    2. आरटी पर 5 मिनट के लिए मिश्रण एक भंवर मिक्सर या अंत से अधिक अंत मिक्सर का उपयोग। सुनिश्चित करें कि मोती निलंबन में रहते हैं।
    3. 10 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब रखें। एक नया सूक्ष्म अपकेंद्रित्र neut के 5 μl युक्त ट्यूब eluted नमूना और हस्तांतरण हटायेralization बफर।
    4. प्रक्रिया एक बार और दोहराएँ और eluted नमूने पूल।
    5. एंटीबॉडी एकाग्रता quantitate और डाई करने वाली एंटीबॉडी अनुपात धारा 4 में वर्णित है।

4. गणना डाई करने वाली एंटीबॉडी अनुपात

  1. 280 एनएम (A280) पर और डाई (Amax) के लिए λmax पर एंटीबॉडी डाई साधना के absorbance के उपाय।
  2. एंटीबॉडी एकाग्रता की गणना:
    एंटीबॉडी एकाग्रता (मिलीग्राम / एमएल) = A280 - (× सीएफ एक अधिकतम) / 1.4
    जहां सीएफ डाई (निर्माता द्वारा प्रदान की) के = सुधार कारक।
  3. गणना डाई करने वाली एंटीबॉडी अनुपात:
    डाई करने वाली एंटीबॉडी अनुपात (डीएआर) = (× 150,000 एक अधिकतम) / एबी एकाग्रता (मिलीग्राम / एमएल) × ε डाई
    जहां, ε डाई = अपने absorbance के अधिकतम पर डाई के विलुप्त होने के गुणांक और एंटीबॉडी की आणविक वजन = 150,000 दा।

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Representative Results

उच्च क्षमता चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी मोती का उपयोग कर छोटे अणुओं के साथ एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए एक योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है। एंटीबॉडी, चुंबकीय प्रोटीन जी मोती छोटे अणुओं के साथ लेबल किया जा सकता है पर कब्जा कर लिया उदाहरण फ्लोरोसेंट रंगों के लिए, या तो अमाइन रसायन शास्त्र जो लेबल का उपयोग लाइसिन अमीनो एसिड या thiol रसायन शास्त्र जो एंटीबॉडी के काज क्षेत्र में कम thiols पर लेबल का उपयोग के प्राथमिक amines। एंटीबॉडी और प्रोटीन जी के बीच आत्मीयता 21 और परिणाम मजबूत लेबलिंग प्रतिक्रिया के दौरान एंटीबॉडी का कम से कम नुकसान में है। यह तीन अलग-अलग माउस एंटीबॉडी isotypes (तालिका 1) फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबलिंग के बाद के कुशल वसूली (50-90%) में परिलक्षित जब साधारण शुद्धि की तुलना में है। (चित्रा 2) कुशल वसूली (19 पहले की सूचना दी है कि इसी तरह) Coomassie जैल में भी स्पष्ट है जहां बैंड intensiशुद्ध एंटीबॉडी से भारी और हल्के चेन के संबंधों को और लेबल एंटीबॉडी परिणाम तालिका 1 में सूचना दर्शाते हैं। चुंबकीय प्रोटीन जी मोती कम गैर विशिष्ट बंधन उच्च शुद्ध एंटीबॉडी में जिसके परिणामस्वरूप गुण के रूप में Coomassie जेल (चित्रा 2) में देखा है और दोनों भारी और हल्के चेन fluorescently (चित्रा 2) लेबल रहे हैं। पर मनका लेबलिंग भी चुंबकीय एक प्रोटीन मोती पर किया जा सकता है और कई फ्लोरोसेंट उच्च वसूली और एंटीबॉडी अनुपात (तालिका 2) के लिए अच्छा डाई, जिसके परिणामस्वरूप में रंगों के साथ संगत है।

आकृति 1
चित्रा 1. फ्लोरोसेंट अणुओं के साथ एंटीबॉडी के ऑन-मनका लेबलिंग के योजनाबद्ध। (ए) एंटीबॉडी लेबलिंग thiol रसायन विज्ञान के प्रयोग से। एंटीबॉडी उच्च क्षमता चुंबकीय एक प्रोटीन या चुंबकीय प्रोटीन जी बी पर कब्जा कर रहे हैंईएडीएस डीटीटी या Tris (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP) की तरह एजेंटों को कम करने का उपयोग कर अंतर-श्रृंखला डाइसल्फ़ाइड बांड की कमी से पीछा किया। Thiol प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट रंगों से युक्त maleimide लेबल एंटीबॉडी के लिए जोड़ रहे हैं। लेबल एंटीबॉडी कम पीएच क्षालन से बरामद किया और तुरंत निष्प्रभावी रहे हैं। (बी) एंटीबॉडी लेबलिंग अमाइन रसायन विज्ञान के प्रयोग से। एंटीबॉडी पर उच्च क्षमता चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी मोती कब्जा कर लिया lysines के प्राथमिक amines पर एंटीबॉडी लेबल करने के लिए एमाइन प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट रंगों के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहे हैं। लेबल एंटीबॉडी कम पीएच क्षालन द्वारा eluted और तुरंत निष्प्रभावी रहे हैं। नाथ, एन एट अल। 20 से अनुकूलित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Denaturing एसतीन माउस आईजीजी के डी एस पृष्ठ जेल छवियों शुद्ध और AlexaFluor 532 के साथ लेबल isotypes, पर मनका विधि का उपयोग कर। (ए) Amine प्रतिक्रिया (बी) thiol प्रतिक्रिया। thiol प्रतिक्रियाशील डाई के साथ लेबल एंटीबॉडी की जेल छवियों। लेन 1-6 तालिका 1 में दिखाया नमूने से मेल खाती है। जैल पहले फ्लोरोसेंट स्कैनर का उपयोग imaged और केवल AlexaFluor 532 लेबल एंटीबॉडी भारी और हल्के चेन दिखाने थे। नमूने जहां एंटीबॉडी केवल शुद्ध थे दिखाई नहीं हैं। जैल बाद में एंटीबॉडी कि एंटीबॉडी कि लेबल थे और साथ ही शुद्ध किया गया से भारी और हल्के चेन दिखाने के लिए Coomassie दाग के साथ दाग रहे थे। नाथ, एन एट अल। 20 से अनुकूलित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

amine रिएक्शन thiol रिएक्शन
कुंआ Isotype एंटीबॉडी रिकवरी (माइक्रोग्राम) एंटीबॉडी अनुपात डाई एंटीबॉडी रिकवरी (माइक्रोग्राम) एंटीबॉडी अनुपात डाई
1 माउस IgG1 शुद्धिकरण 54.8 ± 1.8 0 49.2 ± 2.0 0
2 विकार 27.4 ± 3.2 4.2 ± 0.2 46.2 ± 3.5 1.6 ± 0.2
3 माउस IgG2a शुद्धिकरण 85.9 ± 6.4 0 75.3 ± 8.0 0
4 Conjugसमझना 60.7 ± 3.2 4.4 ± 0.1 61.5 ± 7.4 5.5 ± 0.4
5 माउस IgG2B शुद्धिकरण 79.9 ± 6.9 0 73.3 ± 1.4 0
6 विकार 66.7 ± 0.5 5.6 ± 0.1 55.7 ± 0.9 5.2 ± 0.5

तालिका 1:। अमाइन और thiol chemistries का उपयोग करते हुए सेल मीडिया से सीधे तीन माउस आईजीजी isotypes के ऑन-मनका लेबलिंग प्रत्येक नमूना के लिए, 1.0 मिलीलीटर सेल मीडिया के एक विभाज्य सिर्फ चुंबकीय प्रोटीन जी मोती (50 μl घोल) और दूसरा विभाज्य एमाइन प्रतिक्रियाशील AlexaFluor 532 डाई के साथ ऑन-मनका लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था का उपयोग कर एंटीबॉडी की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया गया था। दोनों ही मामलों में एंटीबॉडी वसूलियां गणना की गई है (पाठ में वर्णित के रूप में) एकलेबलिंग प्रतिक्रिया के दौरान एंटीबॉडी घाटा निर्धारित की तुलना में डी। एंटीबॉडी अनुपात करने के लिए डाई भी सभी तीन एंटीबॉडी के लिए गणना की गई। सभी प्रतिक्रियाओं तीन प्रतियों में किया गया। नाथ, एन एट अल से अनुकूलित। 20

चुंबकीय प्रोटीन जी मोती चुंबकीय एक प्रोटीन की माला
एंटीबॉडी रिकवरी (माइक्रोग्राम) एंटीबॉडी अनुपात डाई एंटीबॉडी रिकवरी (माइक्रोग्राम) एंटीबॉडी अनुपात डाई
1 शुद्धिकरण 263.7 ± 10.4 0 269.4 ± 5.1 0
2 AlexaFluor532 182.9 ± 15.3 5.377; 0.04 189.1 ± 6.9 6.9 ± 0.2
3 AlexaFluor647 192.5 ± 2.9 3.3 ± 0.1 112.3 ± 11.4 3.6 ± 0.2
4 fluorescein 179.5 ± 5.3 6.8 ± 0.1 201.5 ± 6.5 6.8 ± 0.1

तालिका 2:। पर मनका तीन अलग-अलग thiol प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट रंगों के साथ माउस IgG2a की लेबलिंग केंद्रित सेल मीडिया के नमूने इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया है कि विधि को दिखाने के लिए भी एंटीबॉडी के विभिन्न राशि के लिए अपनाया जा सकता है। इसके अलावा, विकार प्रतिक्रियाओं चुंबकीय प्रोटीन जी के साथ-साथ चुंबकीय प्रोटीन जी मोती (100 μl घोल) का उपयोग सेल मीडिया केंद्रित एंटीबॉडी शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया गया था 1.0 मिलीलीटर के चुंबकीय प्रोटीन ए एक विभाज्य का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। तीन अन्य 1.0 मिलीलीटर विभाज्यs लेबल और thiol प्रतिक्रियाशील AlexaFluor 532, 647 और AlexaFluor Fluorescein साथ शुद्ध किया गया। एंटीबॉडी वसूलियां गणना की गई है (पाठ में वर्णित के रूप में) और विभिन्न लेबलिंग प्रतिक्रियाओं के लिए की तुलना में। एंटीबॉडी अनुपात करने के लिए डाई भी सभी तीन फ्लोरोसेंट रंगों के लिए गणना की गई। इसी शुद्धि और लेबलिंग चुंबकीय एक प्रोटीन मनकों का उपयोग किया गया था। सभी प्रतिक्रियाओं तीन प्रतियों में किया गया। नाथ, एन एट अल से अनुकूलित। '20

बफर टिप्पणियाँ / विवरण
Amine विकार बफर (10 मिमी सोडियम बाइकार्बोनेट बफर, पीएच 8.5) 1. 0.084 ग्राम सोडियम बिकारबोनिट
2. विआयनीकृत पानी में भंग। पीएच 8.5 करने के लिए समायोजित करें।
3. विआयनीकृत पानी के साथ 100 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
Thiol विकार बफर (1 मिमी EDTA, पीएच 7 के साथ 10 मिमी फॉस्फेट बफर।0) 1. 0.0378 ग्राम सोडियम फास्फेट, अकेले आधार, monohydrate
2. 0.195 ग्राम सोडियम फास्फेट, द्विक्षारकीय, heptahydrate
3. विआयनीकृत पानी में भंग।
4. 1.0 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए EDTA जोड़ें।
5. 7 पीएच को समायोजित करें।
6. विआयनीकृत पानी के साथ 100 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
एंटीबॉडी बंधनकारी / वाशिंग बफर (10 मिमी फॉस्फेट बफर, 7.0 पीएच) 1. 0.0378 ग्राम सोडियम फास्फेट, अकेले आधार, monohydrate
2. 0.195 ग्राम सोडियम फास्फेट, द्विक्षारकीय, heptahydrate
3. विआयनीकृत पानी में भंग। 7 पीएच को समायोजित करें।
4. विआयनीकृत पानी के साथ 100 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
क्षालन बफर (50 मिमी ग्लाइसिन बफर, पीएच 2.7) 1. 0.188 जी ग्लाइसिन
2. विआयनीकृत पानी में भंग। एचसीएल के साथ 2.7 पीएच को समायोजित करें।
3. विआयनीकृत पानी के साथ 50 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
निराकरण बफर (2 एम Tris बफर, पीएच 7.5) 1. 0.472 जीtrizma आधार
2. 2.54 छ trizma हाइड्रोक्लोराइड
3. विआयनीकृत पानी में भंग। पीएच 7.5 करने के लिए समायोजित करें।
4. विआयनीकृत पानी के साथ 10 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।

तालिका 3: बफर रचनाओं।

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Discussion

इस अध्ययन का लक्ष्य, एंटीबॉडी, कम मात्रा में सेल मीडिया में मौजूद लेबल करने के लिए छोटे अणुओं की एक किस्म के साथ एक विधि विकसित करने के लिए किया गया था। इस तरह की एक विधि एंटीबॉडी की एक बड़ी संख्या है, एंटीबॉडी खोज के प्रारंभिक दौर के दौरान की अनुमति देगा, छोटे अणुओं के साथ लेबल और एक जैविक रूप से प्रासंगिक परख का उपयोग कर जांच की। ऐसा ही एक परख रिसेप्टर की मध्यस्थता एंटीबॉडी internalization परख जहां internalization भी इसी तरह के बाध्यकारी समानताएं साथ एंटीबॉडी के बीच भिन्न हो सकते है। इसलिए, यह पारंपरिक एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) आधारित स्क्रीनिंग के अलावा उनके internalization गुणों के लिए विशेष रूप से एंटीबॉडी स्क्रीन करने के लिए महत्वपूर्ण है। विधि जल्दी एंटीबॉडी विकास के स्तर पर एंटीबॉडी लेबल करने के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकताओं हैं: एक) सेल मीडिया से सीधे एंटीबॉडी लेबल करने की क्षमता; ख) उदाहरण के लिए, कम मात्रा में उपस्थित एंटीबॉडी लेबल करने के लिए जब सेल मीडिया में एंटीबॉडी एकाग्रता 50 माइक्रोग्राम / एमएल है की क्षमता; सी)लेबल एंटीबॉडी और एंटीबॉडी एकाग्रता की पवित्रता बहाव के अनुप्रयोगों के साथ संगत होना चाहिए; घ) विधि दोनों अमाइन और thiol आधारित विकार रसायन विज्ञान के साथ संगत होना चाहिए; ई) विधि एक साथ कई नमूने प्रसंस्करण के साथ संगत होना चाहिए।

इन आवश्यकताओं को ध्यान में रखते हुए, हम उच्च क्षमता चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी मोती का उपयोग कर एक पर मनका एंटीबॉडी लेबलिंग और शोधन विधि विकसित की है। ये मोती कम गैर विशिष्ट बंधन गुणों के साथ हाइड्रोफिलिक सेल्यूलोज पर आधारित है और अत्यधिक शुद्ध एंटीबॉडी तैयारी में परिणाम के रूप में कर रहे हैं चित्रा 2 में दिखाया गया है। मोतियों की उच्च क्षमता का मतलब है कि मोती की एक छोटी राशि कुशलता से मीडिया और एंटीबॉडी कर सकते हैं से एंटीबॉडी कब्जा कर सकते हैं एक छोटी मात्रा इसलिए एंटीबॉडी ध्यान में eluted किया। तालिका 1 में, केवल 10 μl बसे मोती 1.0 मिलीलीटर नमूने से एंटीबॉडी (उम्मीद सांद्रता 50-100 माइक्रोग्राम / एमएल) एक पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गयाडी लेबल एंटीबॉडी 200-500 माइक्रोग्राम / एमएल के बीच सांद्रता में एक 120 μl मात्रा में eluted थे। इन सांद्रता सेल आधारित internalization प्रयोगों जहां ठेठ एंटीबॉडी सांद्रता 1.0 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर से 10 एनजी / एमएल 15,16 करने के लिए सीमा के साथ संगत कर रहे हैं। पर मनका लेबलिंग विधि दोनों अमाइन और thiol chemistries और डाई करने वाली एंटीबॉडी अनुपात की एक विस्तृत श्रृंखला के लेबल एंटीबॉडी (तालिका 1) के कुशल वसूली के साथ-साथ प्राप्त किया जा सकता है के साथ संगत है। प्रयोगों triplicates में किया गया था और करने के लिए 12 नमूने मैन्युअल समानांतर में संभाल रहे थे, काफी प्रसंस्करण समय को कम करने। लेबलिंग के throughput आगे रोबोट प्लेटफार्मों का उपयोग कर के रूप में यह अन्य अनुप्रयोगों चुंबकीय मोती 19,22 का उपयोग करने में दिखाया गया है की वृद्धि हुई किया जा सकता है।

उच्च एंटीबॉडी राशि के साथ नमूने आसानी जबकि एंटीबॉडी वसूली और लेबलिंग कुशल बनाए रखने को पकड़ने के लिए इस्तेमाल किया मोतियों की मात्रा में वृद्धि से समायोजित किया जा सकता हैncy (तालिका 2)। विधि इतना है कि विभिन्न डाई एंटीबॉडी conjugates बनाया जा सकता है, तथापि, डाई करने वाली एंटीबॉडी अनुपातों अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी भी कई रंगों के साथ संगत है। 2-4 की एंटीबॉडी अनुपात करने के लिए डाई इष्टतम 11,12 होने के लिए निर्धारित किया गया है और मंजूरी दे दी एडीसी के मामले में एंटीबॉडी प्रति 3.5 दवाओं के एक औसत 23 सूचित किया गया है। पर मनका विकार रसायन विज्ञान के साथ, यह नीचे की ओर आवेदन की आवश्यकताओं के आधार पर एंटीबॉडी प्रति छोटे अणु की अधिकतम संख्या धुन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है। इसके अलावा, लेबलिंग के लिए दोनों thiol और अमाइन रसायन विज्ञान के लिए सबसे अच्छा विकल्प है जो रसायन विज्ञान एडीसी के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह दिखाया गया है कि प्रतिजन और रिसेप्टर बंधन, विवो स्थिरता का निर्धारण करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है, और एंटीबॉडी के चिकित्सीय गतिविधि विकार रसायन शास्त्र 24 पर निर्भर करता है 25।

वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कारकों अच्छा एंटीबॉडी लेबलिंग और वसूली के लक्ष्य को हासिल करने के लिए कर रहे हैं। छोटे अणु एक के गुणदोनों एंटीबॉडी वसूली और एंटीबॉडी के अनुपात में डाई के लिए महत्वपूर्ण ड्राइवर रहे हैं। एक हाइड्रोफोबिक छोटे अणु के लिए, एंटीबॉडी के अनुपात में उच्च डाई मनका के लिए लेबल एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट चिपके हुए हैं और काफी कम एंटीबॉडी वसूली का कारण होगा। कभी कभी, डाई और एंटीबॉडी विशेषताओं के आधार पर, हमने पाया है कि एक मनका इसलिए दूसरे से बेहतर काम कर सकते हैं, अनुकूलन के दौरान दोनों मोती के परीक्षण के लिए उपयोगी हो सकता है। एक प्रोटीन और प्रोटीन जी विभिन्न प्रजातियों में से एंटीबॉडी के लिए और विभिन्न उपप्रकार है, जो जब उचित मोती का चयन विचार किया जाना चाहिए के विभिन्न समानताएं 21 लोगों की है। उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन माउस IgG1 के लिए कम समानता इसलिए प्रोटीन जी मोतियों की जोरदार सिफारिश कर रहे हैं। thiol रसायन विज्ञान के लिए, डीटीटी और TCEP एजेंटों को कम करने के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करते हैं। डीटीटी हालांकि maleimide प्रतिक्रिया इसलिए पूरी तरह से धोने से हटा दिया जाना चाहिए के साथ हस्तक्षेप करेगा। 2.7 की कम पीएच क्षालन के लिए सिफारिश की है, लेकिन 2.2 से कम पीएच कुशल आरईसी के लिए आवश्यक हो सकता हैकुछ मामलों में ओवरी। लेबल एंटीबॉडी कि कम पीएच पर denature सकता है के लिए कुशल वसूली और एंटीबॉडी कार्यक्षमता के बीच एक संतुलन अनुभव से निर्धारित करना होगा। यह सर्वविदित है कि लेबलिंग रसायन विज्ञान एंटीबॉडी प्रतिजन बाध्यकारी गतिविधि 11,23 प्रभाव हो सकता है, इसलिए, यह बिल्कुल आवश्यक वांछित बहाव के आवेदन का उपयोग लेबलिंग के बाद एंटीबॉडी कार्यक्षमता के लिए परीक्षण करने के लिए है।

सारांश में, हम किसी भी पूर्व शुद्धि चरणों के बिना सेल मीडिया से सीधे फ्लोरोसेंट रंगों के साथ एंटीबॉडी लेबल करने के लिए एक विधि का वर्णन। इस विधि को उच्च क्षमता चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी मोतियों का लाभ उठाता है और उच्च सांद्रता 10,11 पर अत्यधिक शुद्ध एंटीबॉडी की आवश्यकता समाधान आधारित लेबलिंग विधि पर एक महत्वपूर्ण सुधार है। चुंबकीय मोतियों के उपयोग पुस्तिका के रूप में अच्छी तरह से स्वचालित नमूना हैंडलिंग, जो गैर-चुंबकीय मनका आधारित लेबलिंग तकनीक 17,18 पर एक फायदा है सक्षम बनाता है। अंत में, उच्च क्षमता के उपयोग बियाडी एस मोतियों की थोड़ी मात्रा का उपयोग कर माइक्रोग्राम की सैकड़ों करने के लिए कम माइक्रोग्राम स्तर से एंटीबॉडी लेबलिंग प्रतिक्रिया के पैमाने की अनुमति और अन्य चुंबकीय मनका आधारित लेबलिंग तरीकों 19 से इस विधि differentiates। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट रंगों के साथ एंटीबॉडी की लेबलिंग का वर्णन करता है लेकिन विधि बायोटिन, साइटोटोक्सिक दवाओं और संभवतः एंजाइमों सहित अन्य लेबल के लिए बढ़ाया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Magne Protein A Beads Promega Corporation  G8781
Magne Protein G Beads Promega Corporation   G7471
AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) Life Technologies A20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide) Life Technologies A10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimide) Life Technologies A20347
Fluorescein-ME (Maleimide) Life Technologies F-150
Magnetic Stand Promega Z5332

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 115 एंटीबॉडी लेबलिंग एंटीबॉडी internalization फ्लोरोसेंट डाई एंटीबॉडी दवा साधना चुंबकीय एक प्रोटीन मोती चुंबकीय प्रोटीन जी मोती
फ्लोरोसेंट रंजक के साथ एंटीबॉडी लेबलिंग चुंबकीय एक प्रोटीन और प्रोटीन जी मोतियों का उपयोग
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Nath, N., Godat, B., Urh, M.… More

Nath, N., Godat, B., Urh, M. Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads. J. Vis. Exp. (115), e54545, doi:10.3791/54545 (2016).

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