Summary
Den on-bead förfarande för märkning av antikroppar med små molekyler möjliggör märkning av en liten mängd av antikroppar direkt från cellmedia. Denna metod är kompatibel med amin och tiol kemi och kan hantera flera prover parallellt, manuellt eller med hjälp av automatiserade plattformar.
Abstract
Antikroppar märkta med små molekyler som fluorescerande färgämnen, cytostatika och radioaktiva spårämnen är viktiga verktyg inom biomedicinsk forskning, immunodiagnostik och på senare tid som terapeutiska medel. Traditionella metoder för märkning av antikroppar med små molekyler kräver renade antikroppar vid relativt hög koncentration, involvera flera dialyssteg och har begränsad genomströmning. Men flera tillämpningar, inklusive området för antikropp läkemedelskonjugat (ADC), kommer att gynnas av nya metoder som gör att märkning av antikroppar direkt från cellmedia. Sådana metoder kan tillåta antikroppar att screenas i biologiskt relevanta analyser, till exempel, den receptormedierade antikropp interna assay i fallet med ADCs. Här beskriver vi en (metod on-bead) metod som möjliggör märkning av små mängder av antikroppar direkt från cellmedia. Detta tillvägagångssätt använder hög kapacitet magnetisk Protein A och Protein G affinitetspärlor att fånga antikropparfrån cellmedia följt av märkning med små molekyler med användning av antingen aminen eller tiol kemi och efterföljande eluering av de märkta antikropparna. Ta fluorescerande färgämnen som surrogat för små molekyler, visar vi on-bead märkning av tre olika musantikroppar direkt från cellmedia med användning av både amin och tiol märkning kemi. Den höga bindningsaffiniteten av antikroppar till protein A och protein G säkerställer höga utbyten samt hög renhet av de märkta antikropparna. Dessutom, användning av magnetiska pärlor kan flera prover som skall hanteras manuellt, vilket avsevärt förbättrar märkning genomströmning.
Introduction
Antikroppar märkta med små molekyler är kanske de vanligaste reagens i biologi 1,2. Antikroppar märkta med fluorescerande färgämnen och biotin används flitigt i bildbehandling, immun, flödescytometri, western blöts, och immunoprecipitation bland andra program 3-6. Radioaktivt märkta antikroppar 3,7 finna omfattande användning i diagnostik och behandling, antikroppar märkta med cytostatika (ADC) erbjuder nya alternativ för behandling av cancer, och två ADC har redan godkänts för terapeutisk användning 8. Trots sin omfattande användning, har metoder för att märka antikroppar förblev förvånansvärt oförändrad och innefattar typiskt flera reaktioner och avsaltning steg 9-12. Lösningsmetoder fungerar mycket bra i de fall där endast ett fåtal antikroppar måste märkas och finns i högrenad form vid hög koncentration och i tillräckliga volymer. Men för nyare applikationer som ADC, det finns enbehöver för att märka antikroppar vid den tidiga hybridom stadium så att de kan screenas med avseende biologiskt relevanta egenskaper, till exempel, receptorförmedlad antikropp interna 13-16. Vid hybridomet skede provvolymer är begränsade, antikroppar uttrycks vid låga koncentrationer och ett antal prover är stora, därav lösning baserad märkningsmetoder är inte lämpliga.
För att förenkla och förbättra genomströmningen av de traditionella antikroppsmärkning metoder har några alternativa metoder föreslagits 17,18. Ett tillvägagångssätt är att använda icke-magnetiska protein A affinitetspärlor packade i små kolonner för att fånga antikroppar följt av märkningsreaktionen och eluering av märkt och renat protein. Denna metod kan användas för att märka antikroppar direkt från cellmedia, emellertid, kan användningen av kolumnerna mödosam. En magnetisk pärla baserad metod har nyligen rapporterats 19 som eliminerar användningen av kolonner och förbättrar genomströmning men på grundav den begränsade antikroppsbindande kapacitet av pärlorna, kunde bara nanogram till låga mikrogramkvantiteter av antikropparna märkas.
Vi har nyligen utvecklat och använt hög kapacitet magnetisk Protein A och Protein G pärlor (> 20 mg av humant IgG / ml av avvecklade pärlor) för att märka antikroppar närvarande i cell media med små molekyler 20. Den höga kapaciteten av pärlorna gör att tiotals till hundratals mikrogram av antikropp som skall märkas enkelt och den snabba magnetiska respons av pärlorna förenklar hantering och bearbetning av ett stort antal prover parallellt. Användning av fluorescerande färgämnen som surrogat för små molekyler, visar vi att metoden är kompatibel med amin och tiol märkning kemi och erbjuder höga utbyten av märkta och mycket rena antikroppar.
Detta protokoll och tillhörande video beskriver på pärla märkning av mus-antikroppar närvarande i cellen media med Magnetic Protein A och protein G pärlor. Protokollet äruppdelad i fyra sektioner: Avsnitt 1 beskriver infångandet av antikroppar på pärlan från biologiska prover. Efter infångning är märkning av antikroppar med fluorescerande färg med hjälp av amin kemi eller använda tiol kemin beskriven i avsnitt 2 och 3 § respektive. Slutligen, avsnitt 4 beskriver metoden för beräkning av antikroppskoncentrationen och färgämnet till antikropp förhållande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Antikropp Capture på High Capacity Magnetic Protein A eller magnetisk protein G pärlor
- Jämnt återsuspendera magnetiska pärlor efter försiktig skakning. Håll upphängnings uniform när alikvotering pärlor.
- Tillsätt 50 pl av pärluppslamningen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Placera i den magnetiska står för 10 sek. Försiktigt bort buffertminnet.
- Tillsätt 250 pl av antikroppbindningsbuffert.
- Blanda och placera i den magnetiska står för 10 sek. Försiktigt bort bindningsbuffert.
- Tillsätt 1,0 ml av provet innehållande 50-100 ng av antikropp till pärlorna. Prover kan renas antikroppar eller antikroppar i cellmedia.
- Blanda provet under 60 min vid RT med användning av en virvelblandare eller end-over-end mixer.
- Placera röret i den magnetiska stativ för 10 sekunder och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 250 pl av antikroppbindnings / tvättbuffert och blanda. Placera i den magnetiska stå i 10 sekunder och ta bort bindning / tvättbuffert. Upprepa detta ärTep för totalt två tvättar.
- Fortsätt till avsnitt 2 för att märka antikroppar med användning av amin kemi eller avsnitt 3 för att märka antikroppar med användning av tiol kemi.
2. Antikropp Labeling Använda Amine Chemistry
- konjugat Antikropp
- Tillsätt 100 pl av amin konjugering buffert till pärlorna.
- Upplösa aminreaktiva fluorescerande färgämnen (Alexafluor 532-SE) vid 10 mg / ml genom tillsats av 100 | il dimetylsulfoxid (DMSO) till 1,0 mg färgämne. Blanda genom att vortexa. Gör denna lösning omedelbart före användning.
- Tillsätt 2,5 pl av aminreaktiv färgämne för 100 pg av antikroppen.
Not: Normalt en 5-20 molärt överskott av reaktivt färgämne rekommenderas. Emellertid mängden reaktivt färgämne sattes till reaktions måste empiriskt optimeras beroende på önskad färgämne till antikropp-förhållande och inneboende antikropps egenskaper. - Blanda provet under 60 min vid RT med användning av en virvelblandare eller end-over-end mixer. Se till att pärlorna förblir i suspension.
- Placera röret i den magnetiska stativ för 10 sekunder och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 250 pl av antikroppbindnings / tvättbuffert och blanda. Placera i den magnetiska står för 10 sek. Ta bort och kassera bindning / tvättbuffert. Upprepa detta steg för totalt två tvättar.
- antikropp Recovery
- Tillsätt 50 pl av elueringsbuffert till pärlorna.
- Blanda under 5 min vid RT med användning av en virvelblandare eller end-over-end mixer. Se till att pärlorna förblir i suspension.
- Placera röret i den magnetiska stativ för 10 sek. Ta eluerade provet och förflyttas till en ny mikro-centrifugrör innehållande 5 pl neutralisering buffert.
- Upprepa processen en gång till och slå samman de eluerade proverna.
- Kvantifiera antikroppskoncentrationen och färgämnes-till-antikroppsförhållandet som beskrivs i avsnitt 4.
3. Antikropp Labeling Använda Thiol Chemistry
- antikropp Reduktion
- Tillsätt 250 | ilav tiol konjugering buffert och blanda. Placera röret i den magnetiska stativ för 10 sek. Ta bort och kassera bufferten. Upprepa detta steg två gånger.
- Tillsätt 100 pl tiol konjugering buffert.
- Lägga Ditiotreitol (DTT) till en slutlig koncentration av 2,5 mM.
- Blanda provet under 60 min vid RT med användning av en virvelblandare eller end-over-end mixer. Se till att pärlorna förblir i suspension.
- Placera röret i den magnetiska stativ för 10 sek och kasta bufferten.
- Lägg 250 pl tiol konjugering buffert och blanda. Placera röret i den magnetiska stativ för 10 sek. Ta bort och kassera bufferten. Upprepa detta steg för totalt två tvättar.
- Tillsätt 100 pl tiol konjugering buffert.
- konjugat Antikropp
- Upplösa tiolreaktiva färgämnet vid 10 mg / ml genom tillsats av 100 | il DMSO till 1,0 mg färgämne. Blanda genom att vortexa. Gör denna lösning omedelbart före användning.
- Tillsätt 2,5 pl av tiol-reaktivt färgämne för 100 | j, g av antikropp.
Not: Normalt en 5-20 molärt överskott av reaktivt färgämne rekommenderas. Emellertid mängden reaktivt färgämne sattes till reaktions måste empiriskt optimeras beroende på önskad färgämne till antikropp-förhållande och inneboende antikropps egenskaper. - Blanda provet under 60 min vid RT med användning av en virvelblandare eller end-over-end mixer. Se till att pärlorna förblir i suspension.
- Placera röret i den magnetiska stativ för 10 sek och avlägsna supernatanten.
- Lägg 250 pl tiol konjugering buffert och blanda. Placera i den magnetiska står för 10 sekunder och avlägsna bufferten. Upprepa detta steg för totalt två tvättar.
- eluera Antikropp
- Tillsätt 50 pl av elueringsbuffert till pärlorna.
- Blanda under 5 min vid RT med användning av en virvelblandare eller end-over-end mixer. Se till att pärlorna förblir i suspension.
- Placera röret i den magnetiska stativ för 10 sek. Ta eluerade provet och förflyttas till en ny mikro-centrifugrör innehållande 5 pl Neutralization buffert.
- Upprepa processen en gång till och slå samman de eluerade proverna.
- Kvantifiera antikroppskoncentrationen och färgämnes-till-antikroppsförhållandet som beskrivs i avsnitt 4.
4. Beräkna Dye-till-antikropp Ratio
- Mät absorbansen hos antikropp-färgämnes konjugatet vid 280 nm (A280) och vid Xmax för färgämnet (Amax).
- Beräkna koncentrationen antikropp:
Antikropp Koncentration (mg / ml) = A280 - (A max × CF) / 1,4
där CF = Korrektionsfaktor av färgämnet (tillhandahålls av tillverkaren). - Beräkna dye-till-antikroppsförhållandet:
Dye-till-Antibody Ratio (DAR) = (A max x 150000) / Ab-koncentration (mg / ml) x ε färgämne
där, ε färgämne = extinktionskoefficienten för färgämnet vid dess absorbansmaximum och molekylvikten hos antikroppen = 150000 Da.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk för att märka antikroppar med små molekyler med användning av hög kapacitet magnetisk Protein A och Protein G pärlor visas i figur 1. Antikroppar fångas på den magnetiska Protein G pärlor kan märkas med små molekyler, t ex fluorescerande färgämnen, med användning av antingen aminkemi vilka etiketter primära aminer av lysin aminosyror eller användning av tiol kemi vilka etiketter på de reducerade tioler i gångjärnsregionen av antikropparna. Affiniteten mellan antikroppar och protein G är stark 21 och resulterar i minimal förlust av antikropp under märkningsreaktionen. Detta återspeglas i den effektiva återvinningen (50-90%) av tre olika isotyper musantikropp (tabell 1) efter märkning med de fluorescerande färgämnena i jämförelse med enkel rening. Effektiv återvinning (liknande den som rapporterats tidigare 19) är också tydlig i Coomassie-geler (figur 2), där bandet intensibanden av de tunga och lätta kedjorna från de renade antikroppar och märkta antikroppar återspeglar resultatet rapporteras i tabell 1. Magnetisk protein G pärlor har låga icke-specifika bindningsegenskaper som resulterar i höggradigt renade antikroppar som sett i Coomassie-gel (Figur 2) och båda de tunga och lätta kedjorna är fluorescensmärkt (Figur 2). On-bead märkning kan också göras på Magnetiska Protein A-kulor och är kompatibel med flera fluorescerande färgämnen som resulterar i hög återvinning och bra färgämne till förhållanden antikropps (tabell 2).
Figur 1. Schematisk av on-bead märkning av antikroppar med fluorescerande molekyler. (A) Antikropps märkning med hjälp av tiol kemi. Antikroppar fångas på hög kapacitet magnetisk protein A eller magnetisk Protein Gbeads följt av reduktion av mellan kedjor disulfidbindningar med användning av reduktionsmedel såsom DTT eller tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP). Tiolreaktiv maleimid innehållande fluorescerande färgämnen läggs till märka antikroppar. Märkta antikroppar utvinns genom lågt pH-eluering och neutraliserades omedelbart. (B) Antikropp märkning med hjälp av aminkemi. Antikroppar fångat på hög kapacitet magnetisk Protein A och Protein G Beads reageras med amin-reaktiva fluorescerande färgämnen för att märka antikroppar vid de primära aminerna av lysiner. Märkta antikroppar elueras genom lågt pH-eluering och neutraliserades omedelbart. Anpassad från Nath, N. et al. 20 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Denaturering SDS-PAGE gel bilder av tre mus-IgG isotyper renas och märkt med Alexafluor 532, med hjälp av on-pärla metod. (A) Amin reaktion (B) tiol reaktion. Gel bilder av antikroppar märkta med tiol-reaktivt färgämne. Lanes 1-6 motsvarar proverna som visas i tabell 1. Geler först avbildas med fluorescerande scanner och visar endast Alexafluor 532 märkt antikropp tunga och lätta kedjor. Prover där antikroppar endast renades inte syns. Gelerna färgades därefter med Coomassie fläck att visa tunga och lätta kedjor från antikroppar som renades samt antikroppar som har märkts. Anpassad från Nath, N. et al. 20 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| amin Reaktion | tiol Reaktion | |||||
| Väl | isotyp | Antikropp Recovery (ig) | Färgämne till antikropp Ratio | Antikropp Recovery (ig) | Färgämne till antikropp Ratio | |
| 1 | mus lgG1 | Rening | 54,8 ± 1,8 | 0 | 49,2 ± 2,0 | 0 |
| 2 | Konjugation | 27,4 ± 3,2 | 4,2 ± 0,2 | 46,2 ± 3,5 | 1,6 ± 0,2 | |
| 3 | mus IgG2A | Rening | 85,9 ± 6,4 | 0 | 75,3 ± 8,0 | 0 |
| 4 | Conjugation | 60,7 ± 3,2 | 4,4 ± 0,1 | 61,5 ± 7,4 | 5,5 ± 0,4 | |
| 5 | mus IgG2b | Rening | 79,9 ± 6,9 | 0 | 73,3 ± 1,4 | 0 |
| 6 | Konjugation | 66,7 ± 0,5 | 5,6 ± 0,1 | 55,7 ± 0,9 | 5,2 ± 0,5 | |
Tabell 1:. On-pärla märkning av tre mus IgG isotyper direkt från cell media med amin och tiol kemi För varje prov, en portion av 1,0 ml cellmedia användes bara för rening av antikroppar med hjälp av magnetisk protein G pärlor (50 pl flyt) och andra portion användes för on-pärla märkning med aminreaktiva Alexafluor 532 färgämne. Antikroppsåtervinningar i båda fallen beräknades (som beskrivs i texten) end jämförs för att bestämma förluster antikropps under märkningsreaktionen. Färgämne till antikropp-förhållande beräknades också för alla tre antikropparna. Alla reaktioner genomfördes i form av trippelprover. Anpassad från Nath, N. et al. 20
| Magnetic Protein G Pärlor | Magnetisk Protein A-kulor | ||||
| Antikropp Recovery (ig) | Färgämne till antikropp Ratio | Antikropp Recovery (ig) | Färgämne till antikropp Ratio | ||
| 1 | Rening | 263,7 ± 10,4 | 0 | 269,4 ± 5,1 | 0 |
| 2 | AlexaFluor532 | 182,9 ± 15,3 | 5,377; 0,04 | 189,1 ± 6,9 | 6,9 ± 0,2 |
| 3 | AlexaFluor647 | 192,5 ± 2,9 | 3,3 ± 0,1 | 112,3 ± 11,4 | 3,6 ± 0,2 |
| 4 | fluorescein | 179,5 ± 5,3 | 6,8 ± 0,1 | 201,5 ± 6,5 | 6,8 ± 0,1 |
Tabell 2:. On-bead märkning av mus IgG2A med tre olika tiolreaktiva fluorescerande färgämnen Koncentrerade cellmedieprover användes i detta experiment för att visa att metoden kan också antas för olika mängd antikropp. Dessutom har konjugeringsreaktioner utfördes med användning av magnetiska protein G samt magnetisk protein A. En alikvot av 1,0 ml koncentrerad cellmedia användes för antikroppsrening med användning av Magnetisk protein G-pärlor (100 pl uppslamning). Tre andra 1,0 ml alikvots märktes och renades med tiol-reaktiva Alexafluor 532, Alexafluor 647 och fluorescein. Antikroppsåtervinningar beräknades (såsom beskrivs i texten) och jämförs med avseende olika märkningsreaktioner. Färgämne till antikropp-förhållande beräknades också för alla tre fluorescerande färgämnen. Liknande rening och märkning utfördes med hjälp av magnetisk Protein A-kulor. Alla reaktioner genomfördes i form av trippelprover. Anpassad från Nath, N. et al. "20
| Buffert | Kommentarer / Beskrivning |
| Amin konjugering buffert (10 mM natriumvätekarbonatbuffert, pH 8,5) | 1. 0,084 g natriumbikarbonat 2. Lös upp i avjoniserat vatten. Justera till pH 8,5. 3. Justera den slutliga volymen till 100 ml med avjoniserat vatten. |
| Tiol konjugering buffert (10 mM fosfatbuffert med 1 mM EDTA, pH 7.0) | 1. 0,0378 g natriumfosfat, monobasiskt, monohydrat 2. 0,195 g natriumfosfat, dibasiskt, heptahydrat 3. Lös i avjoniserat vatten. 4. Tillsätt EDTA till en slutkoncentration av 1,0 mM. 5. Justera till pH 7. 6. Justera den slutliga volymen till 100 ml med avjoniserat vatten. |
| Antikroppsbindande / tvättbuffert (10 mM fosfatbuffert, pH 7,0) | 1. 0,0378 g natriumfosfat, monobasiskt, monohydrat 2. 0,195 g natriumfosfat, dibasiskt, heptahydrat 3. Lös i avjoniserat vatten. Justera till pH 7. 4. Justera den slutliga volymen till 100 ml med avjoniserat vatten. |
| Elueringsbuffert (50 mM glycin-buffert, pH 2,7) | 1. 0,188 g glycin 2. Lös upp i avjoniserat vatten. Justera pH till 2,7 med HCl. 3. Justera den slutliga volymen till 50 ml med avjoniserat vatten. |
| Neutraliseringsbuffert (2 M Tris-buffert, pH 7,5) | 1. 0,472 gTrizma bas 2. 2,54 g trizma hydroklorid 3. Lös i avjoniserat vatten. Justera till pH 7,5. 4. Justera den slutliga volymen till 10 ml med avjoniserat vatten. |
Tabell 3: Buffert kompositioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denna studie var att utveckla en metod för att märka antikroppar, som föreligger i cellmediet vid låga koncentrationer, med en mängd olika små molekyler. En sådan metod kommer att möjliggöra ett stort antal antikroppar, under de tidiga stadierna av antikropp upptäckt, som ska märkas med små molekyler och screenades med användning av en biologiskt relevant analys. En sådan analys är receptorförmedlad antikropp interna analys där internalisering kan variera mellan antikroppar även med liknande bindningsaffiniteter. Därför är det viktigt att undersöka antikroppar som är specifikt för deras internalise egenskaper utöver traditionella enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) baserad screening. De viktigaste kraven för metoden för att märka antikroppar vid antikroppsutveckling ett tidigt skede är: a) förmåga att märka antikroppar direkt från cellmedier; b) förmåga att märka antikroppar närvarande vid låga koncentrationer, t ex när koncentrationen antikropp i cellmedium är 50 | j, g / ml; c)renheten hos den märkta antikroppen och antikroppskoncentrationen bör vara förenliga med nedströmstillämpningar; d) Metoden bör vara förenliga med både amin och tiol baserad konjugeringskemi; e) Metoden bör vara förenligt med bearbetning av flera prover samtidigt.
Med tanke på dessa krav har vi utvecklat en antikropp märkning och reningsmetod på pärla med hjälp av hög kapacitet magnetisk Protein A och protein G pärlor. Dessa pärlor är baserade på hydrofila cellulosa med låga icke-specifika bindningsegenskaper och resultera i höggradigt ren antikroppsberedning såsom visas i figur 2. Den höga kapaciteten av pärlorna gör att en liten mängd av pärlor effektivt kan fånga antikroppar från media och antikropparna kan elueras i en liten volym därmed koncentrera antikropparna. I tabell 1, fast endast 10 ^ pärlor användes för att fånga antikroppar från 1,0 ml prover (förväntade koncentrationerna 50-100 mikrogram / ml) end märkta antikroppar eluerades i en 120 | il volym vid koncentrationer mellan 200-500 | j, g / ml. Dessa koncentrationer är förenliga med cellbaserade interna experiment där typiska antikroppskoncentrationer sträcker sig från 1,0 mikrogram / ml till 10 ng / ml 15,16. Märkningen metoden på pärlan är kompatibel med både amin och tiol kemi och ett brett utbud av färgämne-to-antikropp förhållanden kan uppnås tillsammans med effektiv återvinning av de märkta antikropparna (Tabell 1). Experiment gjordes i triplikat och upp till 12 prover hanterades parallellt manuellt, vilket avsevärt minskar processtiden. Genomströmningen av märkningen skulle kunna ökas ytterligare genom att använda robot plattformar som det har visats i andra tillämpningar som använder magnetiska pärlor 19,22.
Prover med högre antikropps mängden kan lätt tillgodoses genom att öka mängden av pärlor som används för infångning medan återhämtningen antikropp och märkning efficie bibehållandeNCY (tabell 2). Metoden är också kompatibel med flera färgämnen så att olika konjugat färgämnesantikropps kan göras emellertid dye-to-antikropp-förhållanden kommer att behöva optimeras. Färgämne till antikropp förhållande av 4/2 har bestämts vara optimala 11,12 och i fallet med godkända ADCs i genomsnitt 3,5 läkemedel per antikropps har rapporterats 23. Med on-bead konjugeringskemi, är det relativt lätt att trimma ett optimalt antal liten molekyl per antikropps beroende på kraven för den nedströms belägna ansökan. Dessutom kan både tiolen och aminkemi för märkning testas för att bestämma den bästa kemi alternativet vilket är kritiskt för ADCs eftersom det har visats att antigen och receptorbindning, stabilitet in vivo, och terapeutiska aktiviteten hos antikroppen beror på konjugeringskemi 24 25.
Det finns några viktiga faktorer för att uppnå god antikroppsmärkning och återhämtning. Egenskaperna hos den lilla molekylen enre kritiska drivrutin för både återvinning antikropp och färgämne till antikropp förhållande. För en hydrofob liten molekyl, kommer hög färgämne till antikropp förhållande orsaka ospecifik vidhäftning av den märkta antikroppen till pärlan och kraftigt minskad återhämtning antikropp. Ibland, beroende på färgämnet och egenskaper antikropps, fann vi att en vulst kan fungera bättre än ett annat därmed, kan provning av både pärlorna under optimeringen vara användbara. Protein A och Protein G har olika affinitet 21 för antikroppar från olika arter och av olika subtyper, vilket bör beaktas vid val av lämpliga pärlor. Till exempel har protein A låg affinitet för mus IgG1 därmed protein G pärlor rekommenderas starkt. För tiol kemi, DTT och TCEP reduktionsmedel fungerar lika bra. DTT kommer dock störa maleimid reaktion därför bör tas bort helt genom tvättning. Lågt pH av 2,7 rekommenderas för eluering, men lägre pH-värde av 2,2 kan krävas för effektiv recovery i vissa fall. För märkta antikroppar som kan denaturera vid lågt pH en balans mellan effektiv återvinning och funktionalitet antikropp kommer att behöva bestämmas empiriskt. Det är väl känt att märkningen kemi kan påverka antikropp-antigenbindningsaktivitet 11,23, därmed är det absolut nödvändigt att testa funktionalitet antikropp efter märkning med hjälp av önskad applikation nedströms.
Sammanfattningsvis beskriver vi en metod för att märka antikroppar med fluorescerande färgämnen direkt från cellmediet utan föregående reningssteg. Denna metod utnyttjar hög kapacitet magnetisk Protein A och Protein G pärlor och är en betydande förbättring jämfört med lösning baserad märkningsmetod som kräver starkt renade antikroppar vid höga koncentrationer 10,11. Användningen av magnetiska pärlor möjliggör manuell samt automatiserad provhantering, vilket är en fördel jämfört med icke-magnetiskt pärla baserad märkningstekniker 17,18. Slutligen, användning av hög kapacitet beads tillåter uppskalning märkning antikroppreaktion från låga mikrogram nivåer till hundratals mikrogram med hjälp av små mängder av pärlor och skiljer den här metoden från andra magnetisk pärla baserade märkningsmetoder 19. Protokollet presenteras här beskriver märkning av antikroppar med fluorescerande färger men metoden kan utvidgas till andra etiketter inklusive biotin, cytostatika och eventuellt enzymer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
References
- Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
- Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
- Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
- Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
- Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
- Kraeber-Bodere, F., et al.
- Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
- Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. 380-382 (1996).
- Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
- Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
- Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
- Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).
- Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
- Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
- Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
- Strachan, E., et al.
- Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
- Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
- Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
- Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).
- Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
- Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).
