Adenofection: метод изучения роли молекулярных шаперонов в клеточных морфодинамики истощением-спасательных экспериментов
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
Клеточные процессы, такие как митоза и дифференциации клеток регулируется изменением формы клеток, которые в значительной степени полагаются на соответствующую ремоделирования клеточных структур цитоскелета. Это включает в себя монтаж-демонтаж макромолекулярных структур высшего порядка в данный момент времени и местоположения, процесс, который особенно чувствителен к возмущениям, вызванных избыточной экспрессии белков. Методы, которые могут сохранять белковый гомеостаз и поддерживать почти к нормальной клеточной морфологии весьма желательны для определения функционального вклада интересующего белка в широком диапазоне клеточных процессов. Переходные эксперименты истощения-спасательных работ, основанного на интерференции РНК являются мощными подходы для анализа функций белка и структурных требований. Тем не менее, повторное включение в состав белка-мишени с минимальным отклонением от его физиологического уровня является реальной проблемой. Здесь мы опишем метод называется adenofection, который был разработан, чтобы изучить роль молекулярных шапероновг партнеров в нормальной работе делящихся клеток и отношения с актина ремоделирования. HeLa клетки были истощены BAG3 с миРНК дуплексы ориентации на 3'UTR область. GFP-меченных белков BAG3 вновь были введены одновременно в> 75% клеток с использованием рекомбинантных аденовирусов, соединенных с реагентов трансфекции. позволило Adenofection выразить BAG3-GFP белки на близких физиологических уровнях в клетках HeLa, истощенных BAG3, при отсутствии ответа на стресс. Никакого эффекта не наблюдалось на уровни эндогенных белков теплового шока наставниками, основные стресс-индуцируемых регуляторов белка гомеостаза. Кроме того, путем добавления бакуловирусов вождения экспрессии флуоресцентных маркеров во время клеточной трансдукции трансфекции, мы могли бы рассекать динамику митотических клеток путем покадровой микроскопического анализа с минимальным возмущением нормальной прогрессии митоза. Adenofection применимо также к клеткам труднодоступных Infect мыши, и подходит для функциональных анализов миобластов Differentiation в мышечных трубках. Таким образом, adenofection обеспечивает универсальный метод для выполнения структуры-функции анализа белков, участвующих в чувствительных биологических процессов, которые опираются на динамику цитоскелета высшего порядка.
Introduction
Функциональная инактивация экспрессии генов в клетках млекопитающих является золотым стандартом рассекать функции белка. Недавно разработанные технологии редактирования генома , основанные на использовании нуклеаз конкретных участков , таких как нуклеаз цинкового пальца и кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) / cas9 теперь позволяют генерацию клеточных линий с целенаправленным делеции гена и мутации 1,2. Эти новые подходы должны революционизировать способ, которым мы изучаем функцию белка и наше понимание генетики заболеваний человека. В некоторых случаях, однако, долгосрочный или полный нокаут гена не является желательным и может спровоцировать вторичные компенсационные механизмы клеток. Генерирование генетически модифицированных клеточных линий также может быть ограничение при работе с первичными культурами клеток с ограниченной способностью пролиферации, или при скрининге большого множества мутаций в различных типах клеток ищется. Это часто требуется для определения зависимости ячейки Ьiological процесс структурных требований белка. С этой целью, обратимы нокдаун РНК интерференции , который позволяет переходных экспериментов истощения-спасательных работ в различных клеточных фонов по- прежнему остается простой и мощный подход для выполнения структуры-функции анализа интересующего белка 3. Тем не менее, основным недостатком такого подхода является трудность достижения эффективного глушителей и вновь ввести интересующий белок или его вариантов на вблизи физиологических уровней в большинстве клеточной популяции. Это очень важно для того, чтобы комплексные исследования, которые пытаются соотнести функциональные эффекты, наблюдаемые на уровне отдельных клеток (гипоморфными фенотип) с тем, которые наблюдаются в анализах населения на основе клеток, например, на белок-белковых взаимодействий.
Используя классические методы трансфекции, трудно добиться однородной и низкую экспрессию экзогенных белков в большой популяции клеток. Трансдукции клеток с рекомбинантными вирусамикак аденовирусы часто позволяет более нормализованное экспрессии экзогенных белков. Тем не менее, аденовирус поглощение ограничено рецептором CAR, который отсутствует в не-клетках человека или слабо выражены в некоторых типах клеток человека. Кроме того, клеточная запись аденовирусов активирует пути , которые регулируют формы клеток и адгезии 4-6 сигнализации. Это, очевидно, не желательно при изучении механизмов регуляции клеточных морфодинамики. Мы столкнулись с этой проблематикой, когда мы провели функциональный анализ шаперонного комплекса, BAG3-HSPB8, в делении клеток и динамики актина. Новаторская работа была описана роль этого комплекса в шаперонного контроля качества белка и аутофагии во время стресса 7,8. Большинство из этих исследований, однако, полагаться на белок избыточной экспрессии, предполагая, что наставники, как правило, усиливает свою активность во время стресса. Это остается открытым вопрос о том, BAG3, в комплексе с HSPB8, может способствовать нормальному функционированию делящихся клеток, экспрессирующих-еESE наставники , как и многие типы раковых клеток 9. В частности, способствует ли сопровождающий комплекс с перепланировкой актина на основе структур , которые контролируют митоза представляет большой интерес, учитывая возникающие связи между HSPB наставниками и динамики цитоскелета 10. Для решения этой проблемы, мы стремились разработать эффективный метод истощения-спасательных экспериментов, которые не будут мешать митоза или клеточной морфологии, и который позволит сохранить белка гомеостаза чтобы избежать вторичного возмущения динамики макромолекулярных комплексов регулирования изменения клеточного формы , Таким образом, в идеале, истощение-надстройку задней части представляющего интерес гена должны быть выполнены одновременно.
Использование комплексов аденовируса с катионным полимером или липидов было описано для содействия передаче генов в пробирке и в естественных условиях 11,12. Например, фосфат кальция (çapı), как представляется, с образованием осадка саденовирус , которые усиливают вируса связывающего запись через CAR-независимого пути 13. Действительно, мы обнаружили, что объединение на основе аденовирусов трансдукции клеток и трансфекцию с катионными соединениями может повысить эффективность экспериментов истощения-спасательных работ. Это позволило снизить количество вируса от 3- до 20-кратного, в зависимости от клеточной линии и представляющего интерес гена, и извлекают пользу из широкого окна для того, чтобы регулировать экспрессию экзогенных белков на близких эндогенных уровней в большинстве клеточной популяции, представляющей интерес с минимальным воздействием на клеточной морфологии. В таких условиях, мы могли бы также достичь высокой эффективности нокдаун экспрессии эндогенного белка (> 75%). Настоящим описывают шаг за шагом метод и предоставить доказательства того, что белок гомеостаз существенно не возмущенный, оцененной по неизменных уровней индуцированных стрессом шаперонов семейства белков теплового шока, что делает этот метод пригоден для функциональных анализов физиологической роле молекулярных шаперонов путем покадровой видео микроскопии. Протокол поддается процедур синхронизации клеток и с использованием коммерчески доступных бакуловирус для коэкспрессией низких уровней флуоресцентных маркеров, с минимальным вмешательством в нормальных актина основе и шпиндельных динамики во время митоза. Мы также показать универсальность метода, который применим к "трудно трансдукции" С2С12 клетки мыши, без существенного влияния на миобластов дифференцировки в мышечных трубках в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали метод, позволяющий обеднение-спасательные эксперименты должны быть выполнены, который применим к функционального анализа клеточных биологических процессов, которые особенно чувствительны к избыточной экспрессии белков, влияющих на стехиометрии и динамику белковых…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
References
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
- Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts. J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).
- Yousuf, M. A., et al. Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells. PLoS One. 8 (10), e77462 (2013).
- Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. Sci Rep. 3, 2889 (2013).
- Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).
- Fuchs, M., et al. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).
- Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2, e141 (2011).
- Guilbert, S. M., Tanguay, R. M., Hightower, L. E., et al. . The Big Book of Small Heat Shock Proteins. , 435-456 (2015).
- Fasbender, A., et al. Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).
- Toyoda, K., et al. Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).
- Fasbender, A., et al. Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).
- Fuchs, M., et al. A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genetics. 11 (10), e1005582 (2015).
- Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Takahashi, A., et al. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).
- Murray, T. V., et al. A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation. J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).
- Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells). Int J Cell Biol. 2013, 616294 (2013).
- Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion. Sci Signal. 6 (272), re2 (2013).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
