Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
Zelluläre Prozesse, wie beispielsweise die Mitose und Zelldifferenzierung werden durch Änderungen in der Zellform bestimmt, die auf die richtige Remodellierung der Zell Zytoskelettstrukturen weitgehend verlassen. Dabei wird die Montage-Demontage von höherer Ordnung makromolekulare Strukturen zu einem bestimmten Zeitpunkt und Ort, ein Vorgang, der besonders empfindlich gegenüber Störungen durch die Überexpression von Proteinen verursacht wird. Methoden, die Protein-Homöostase und aufrechtzuerhalten in der Nähe zu normalen Zellmorphologie sind höchst wünschenswert, um zu bestimmen die funktionelle Beitrag eines Proteins von Interesse in einer Vielzahl von zellulären Prozessen erhalten kann. Transient Verarmungsrettungsversuche auf Basis von RNA-Interferenz sind leistungsfähige Ansätze Proteinfunktionen und strukturellen Anforderungen zu analysieren. Allerdings Wiedereinführung des Zielproteins mit minimalen Abweichung von seiner physiologischen Ebene ist eine echte Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Methode genannt adenofection das entwickelt wurde, um die Rolle von molekularen Chaperonen zu studieren eind Partner in dem normalen Betrieb von sich teilenden Zellen und die Beziehung mit Aktin-Umbildung. HeLa-Zellen wurden von BAG3 verarmt mit siRNA-Duplexe die 3'UTR Region abzielt. unter Verwendung von rekombinanten Adenoviren gekoppelt Transfektionsreagenzien GFP-markierten BAG3 Proteine wurden gleichzeitig in> 75% der Zellen wieder eingeführt. Adenofection aktiviert BAG3-GFP-Proteine bei nahezu physiologischen Konzentrationen in HeLa-Zellen verarmt BAG3, in Abwesenheit eines Stressreaktion auszudrücken. Es wurde keine Wirkung auf den Ebenen der endogenen Heat Shock Protein Chaperone beobachtet, den Stress-induzierbaren Regulatoren der Protein-Homöostase. Weiterhin kann durch Baculoviren Antreiben der Expression von fluoreszierenden Markern zum Zeitpunkt der Zell Transduktion-Transfektion Zugabe konnten wir mitotischen Zelldynamik durch Zeitraffer mikroskopische Analysen sezieren mit minimaler Störung der normalen mitotischen Progression. Adenofection ist auch auf schwer zu Infect Mauszellen, und geeignet für die funktionelle Analyse von Myoblasten differenzierung in Myotuben. So bietet adenofection eine vielseitige Methode Struktur-Funktion in sensiblen biologischen Prozessen beteiligten Proteine Analysen durchzuführen, die auf höherer Ordnung Dynamik des Zytoskeletts verlassen.
Introduction
Funktionelle Inaktivierung der Genexpression in Säugerzellen ist der Goldstandard Proteinfunktionen zu sezieren. Neu entwickelte Technologien der Genom Bearbeitung 1,2 kurz über die Verwendung von ortsspezifischen Nukleasen wie Zink-Finger – Nukleasen und gruppierten regelmäßig voneinander beabstandete Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CAS9 erlauben nun die Generierung von Zelllinien mit gezielten Gen – Deletion und Mutation basiert. Diese neuen Ansätze sollten revolutionieren die Art, wie wir die Proteinfunktion und unser Verständnis der Genetik von Krankheiten beim Menschen studieren. In einigen Fällen ist nicht wünschenswert, langfristige oder vollständige Gen-Knockout jedoch und kann Sekundärzelle Kompensationsmechanismen hervorrufen. Die Erzeugung von gentechnisch veränderten Zelllinien können auch Begrenzungs sein, wenn sie mit primären Zellkulturen mit begrenzter Proliferationskapazität handelt, oder wenn Screening einer großen Gruppe von Mutationen in verschiedenen Zelltypen gesucht wird. Dies wird oft zur Bestimmung der Abhängigkeit einer Zelle b erforderlicheiologische Prozess auf strukturellen Anforderungen eines Proteins. Zu diesem Zweck reversible Knockdown durch RNA – Interferenz , die noch transiente Depletion-Rettungsversuchen in verschiedenen zellulären Hintergründen ermöglicht weiterhin eine einfache und leistungsstarke Ansatz zur Durchführung Struktur-Funktion eines Proteins von Interesse 3 analysiert. Allerdings ist ein großer Nachteil bei diesem Ansatz die Schwierigkeit, effiziente Silencing zu erreichen, und das Protein von Interesse oder seine Varianten in der Nähe von physiologischen Konzentrationen in einer Mehrheit der Zellpopulation wieder einführen. Dies ist entscheidend, umfassende Studien zu ermöglichen, die funktionelle Effekte auf der Ebene einzelner Zellen (hypomorphen Phänotyp) mit denen in populationsbasierten Zellassays gesehen zu korrelieren versuchen, zum Beispiel auf Protein-Protein-Wechselwirkungen.
Mit klassischen Transfektionsverfahren, kann man kaum erreichen homogene und niedrige Expression von exogenen Proteinen in einer großen Population von Zellen. Transduktion von Zellen mit rekombinanten Virenwie Adenoviren können oft mehr normalisierte Expression von exogenen Proteinen. Doch Adenovirus Aufnahme wird durch den CAR-Rezeptor begrenzt, die in nicht-menschlichen Zellen fehlt oder nur schwach in einigen menschlichen Zelltypen exprimiert. Darüber hinaus aktiviert die Zelleintritt von Adenoviren Signalwege , die Zellform und Haftung 4-6 regulieren. Dies ist natürlich nicht wünschenswert, wenn regulatorische Mechanismen der Zell Morphodynamik studieren. Wir waren mit Blick auf diese Problematik, wenn wir funktionelle Analysen eines Chaperon-Komplex unternahm, BAG3-HSPB8, bei der Zellteilung und Aktindynamik. Pionierarbeit hatte eine Rolle für dieses Chaperon – Komplex in der Proteinqualitätskontrolle und Autophagie bei Stress 7,8 beschrieben. Die meisten dieser Studien stützte sich jedoch auf die Proteinexpression unter der Annahme, dass die Chaperone normalerweise während Stress aufreguliert werden. Dies hat die Frage offen gelassen, ob BAG3, im Komplex mit HSPB8 kann zum normalen Betrieb von sich teilenden Zellen beitragen th exprimierendenese Chaperone wie 9 viele Krebszelltypen. Insbesondere ob trägt das Chaperon – Komplex auf den Umbau des Aktin-basierten Strukturen , die mitotischen Progression von großem Interesse war kontrollieren, 10 die Schwellen Verbindungen zwischen HspB Chaperone und Zytoskelett Dynamik gegeben. Um dieses Problem zu beheben, suchten wir ein effizientes Verfahren zur Depletion-Rettungsversuche zu entwickeln, die nicht mit mitotischen Progression oder zelluläre Morphologie stören würde, und das würde Proteinhomöostase erhalten zur sekundären Störung der Dynamik makromolekularer Komplexe Regelzellformänderungen vermeiden . So ideal, Depletion-Add-Rückseite des Gens von Interesse sollte gleichzeitig ausgeführt werden.
Die Verwendung von Komplexen von Adenovirus mit einem kationischen Polymer oder Lipiden beschrieben wurde Gentransfer in vitro zu fördern , und in vivo 11,12. Beispielsweise Calciumphosphat (CaPi) erscheint, um einen Niederschlag zu bilden, mitAdenovirus , die Virusbindung-Eingabe über eine CAR-unabhängigen Weg 13 zu verbessern. Tatsächlich fanden wir, dass Adenovirus-basierten Kombination Zell Transduktion und Transfektion mit kationischen Verbindungen könnte die Effizienz der Verarmungsrettungsexperimente verbessern. Dies ermöglichte es uns, die Mengen an Virus durch 3- bis 20-fach niedriger, abhängig von der Zelllinie und dem Gen von Interesse, und profitieren von einem breiteren Fenster, um die Expression von exogenen Proteinen in der Nähe von endogenen Konzentrationen in den meisten einzustellen einer Zellpopulation von Interesse mit minimalen Auswirkungen auf die Zellmorphologie. Unter diesen Bedingungen konnten wir auch hohe Effizienz Knockdown endogener Proteinexpression (> 75%) erzielen. Wir beschreiben hiermit das Verfahren Schritt für Schritt und belegen , dass Proteinhomöostase nicht signifikant , wie durch den unveränderten Stress-induzierten Chaperone des Hitzeschockproteinfamilie beurteilt gestört wird, wodurch das Verfahren geeignet für die funktionelle Analyse des physiologischen role von molekularen Chaperonen durch Zeitraffervideomikroskopie. Das Protokoll ist zugänglich Zellensynchronisationsverfahren und die Verwendung von handelsüblichen Baculoviren für die Coexpression von geringen Mengen an Fluoreszenzmarkern, mit minimaler Beeinträchtigung der normalen Aktin-basierten und Spindeldynamik während der mitotischen Progression. Wir zeigen die Vielseitigkeit des Verfahrens, die anwendbar ist , Maus C2C12 – Zellen "schwer zu transduzieren", ohne erhebliche Auswirkungen auf die Myoblastendifferenzierung in Myotuben in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrieben wir ein Verfahren ermöglicht Verarmungsrettungsexperimente durchgeführt werden, die funktionelle Analyse von zellbiologischen Prozessen anwendbar ist, die besonders empfindlich auf eine Überexpression von Proteinen, die Stöchiometrie und die Dynamik von Proteinkomplexen und makromolekulare Strukturen zu beeinträchtigen. Mitotischen Zellteilung ist ein extremes Beispiel für fein abgestimmte Zelle Morphodynamik, die die dramatische und spektakuläre Veränderungen in der Gesamtstruktur einer Zelle b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
References
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
- Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts. J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).
- Yousuf, M. A., et al. Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells. PLoS One. 8 (10), e77462 (2013).
- Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. Sci Rep. 3, 2889 (2013).
- Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).
- Fuchs, M., et al. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).
- Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2, e141 (2011).
- Guilbert, S. M., Tanguay, R. M., Hightower, L. E., et al. . The Big Book of Small Heat Shock Proteins. , 435-456 (2015).
- Fasbender, A., et al. Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).
- Toyoda, K., et al. Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).
- Fasbender, A., et al. Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).
- Fuchs, M., et al. A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genetics. 11 (10), e1005582 (2015).
- Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Takahashi, A., et al. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).
- Murray, T. V., et al. A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation. J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).
- Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells). Int J Cell Biol. 2013, 616294 (2013).
- Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion. Sci Signal. 6 (272), re2 (2013).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
