Adenofection: Um método para estudar o papel de chaperones moleculares em Cellular Morfodinâmica por experimentos depleção de resgate
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
Os processos celulares tais como a mitose e diferenciação das células são regulados por mudanças na forma das células que largamente dependem da remodelação adequada das estruturas do citoesqueleto celular. Isto envolve a montagem-desmontagem de estruturas macromoleculares de ordem superior num dado momento e localização, um processo que é particularmente sensível a perturbações provocadas pela expressão excessiva de proteínas. Métodos que podem preservar a homeostase da proteína e manter a morfologia celular perto-para-normal, são altamente desejáveis para determinar a contribuição funcional de uma proteína de interesse em uma ampla gama de processos celulares. Transitórios experimentos depleção de resgate com base na interferência de RNA são abordagens poderosa para analisar as funções das proteínas e requisitos estruturais. No entanto, a reintrodução da proteína alvo com desvio mínimo a partir do seu nível fisiológico é um verdadeiro desafio. Descrevemos aqui um método denominado adenofection que foi desenvolvido para estudar o papel de um chaperonas molecularesparceiros d no funcionamento normal das células em divisão e a relação com a remodelação da actina. As células HeLa foram esgotados de BAG3 com duplex de siRNA segmentação região 3'UTR. BAG3 proteínas GFP foram reintroduzidos simultaneamente em> 75% das células utilizando adenovírus recombinantes acoplados a reagentes de transfecção. Adenofection activado para expressar proteínas BAG3-GFP em níveis fisiológicos próximos em células HeLa depletados de BAG3, na ausência de uma resposta de stress. Não se observou qualquer efeito sobre os níveis de proteína de choque térmico chaperonas endógenos, os principais reguladores de stress-indutível da proteína homeostase. Além disso, por adição de baculovirus conduz a expressão de marcadores fluorescentes no momento da transdução de células-transfecção, que poderia dissecar dinâmica de células mitóticas por microscopia de lapso de tempo analisa com perturbação mínima de progressão mitótica normal. Adenofection é aplicável também para células de difícil infectar rato, e adequado para análises funcionais de diff mioblastoserentiation em miotubos. Assim adenofection proporciona um método versátil para efectuar análises de estrutura-função de proteínas envolvidas em processos biológicos sensíveis que dependem da dinâmica do citoesqueleto de ordem superior.
Introduction
inactivação funcional da expressão do gene em células de mamífero é o padrão de ouro para dissecar as funções das proteínas. Recém-desenvolvidas tecnologias de edição genoma com base no uso de nucleases específicas do local, tais como nucleases de dedos de zinco e agrupados regularmente intercaladas repete palindr�icas curtas (CRISPR) / CAS9 agora permitem a geração de linhagens celulares com deleção do gene alvejado e mutação 1,2. Estas novas abordagens devem revolucionar a forma como estamos a estudar a função da proteína e da nossa compreensão da genética de doenças humanas. Em alguns casos, no entanto, a longo prazo ou nocaute do gene completo não é desejável e pode provocar mecanismos de compensação de células secundárias. A geração de linhas de células geneticamente modificadas, podem também ser limitante quando se lida com as culturas de células primárias com capacidade de proliferação limitada, ou quando o rastreio de um grande conjunto de mutações em vários tipos de células é procurado. Este é muitas vezes necessária para determinar a dependência de uma célula bprocesso iological sobre os requisitos estruturais de uma proteína. Para o efeito, knockdown reversíveis por interferência de RNA que permite experiências de depleção de resgate transitórios em várias origens celulares continua a ser uma abordagem simples e poderoso para efectuar análises de estrutura-função de uma proteína de interesse 3. No entanto, uma grande desvantagem com esta abordagem é a dificuldade de atingir e silenciamento eficiente para reintroduzir a proteína de interesse ou suas variantes em níveis fisiológicos próximos na maioria da população de células. Este aspecto é crucial para permitir estudos exaustivos que tentativa de correlacionar os efeitos funcionais observadas no nível de células individuais (fenótipo hipomórfico) com aqueles observados em ensaios baseados em população de células, por exemplo, em interacções proteína-proteína.
Usando métodos de transfecção clássicos, dificilmente se pode conseguir a expressão homogênea e baixa de proteínas exógenas em uma grande população de células. A transdução de células com vírus recombinantescomo adenovírus muitas vezes permite a expressão mais normalizado de proteínas exógenas. No entanto, a absorção de adenovírus é limitado pelo receptor de carro, que está ausente em células não-humanos ou apenas fracamente expresso em alguns tipos de células humanas. Além disso, a entrada celular de adenovírus activa as vias que regulam a forma da célula e adesão 4-6 sinalização. Isso obviamente não é desejável quando se estuda mecanismos reguladores da morfodinâmica celulares. Nós voltado para esta problemática quando realizamos análises funcionais de um complexo acompanhante, BAG3-HSPB8, na divisão celular e da dinâmica de actina. Trabalho pioneiro havia descrito um papel para este complexo acompanhante no controle de qualidade de proteínas e autofagia durante o estresse 7,8. A maioria destes estudos, no entanto, a sobre-expressão da proteína invocado, assumindo que as chaperonas são normalmente regulada positivamente durante o stress. Isso deixou em aberto a questão de saber se BAG3, em complexo com HSPB8, pode contribuir para o normal funcionamento das células em divisão expressando thchaperones ese como muitos tipos de células cancerígenas 9. Em particular, se o complexo acompanhante contribui para a remodelação das estruturas de actina que controlam a progressão mitótico foi de grande interesse, dadas as conexões emergentes entre chaperones HSPB e dinâmica do citoesqueleto 10. Para abordar esta questão, estávamos buscando desenvolver um método eficiente para experimentos depleção de resgate que não iria interferir com a progressão da mitose ou morfologia celular, e que preservar a homeostase da proteína para evitar a perturbação secundária da dinâmica dos complexos macromoleculares regulação celular em forma de mudanças . Assim, idealmente, a depleção de complemento de trás do gene de interesse sejam realizadas simultaneamente.
O uso de complexos de adenovírus com um polímero catiónico ou lípidos tem sido descrito para promover a transferência de genes in vitro e in vivo 11,12. Por exemplo, fosfato de cálcio (CAPI) aparece para formar um precipitado comadenovírus que melhoram a ligação do vírus-entrada através de uma via independente de CAR 13. Com efeito, verificou-se que a combinação de transdução de células com base em adenovírus e transfecção com compostos catiónicos podem melhorar a eficiência dos experimentos depleção de salvamento. Isto permitiu-nos reduzir as quantidades de vírus por de 3 a 20 vezes, dependendo da linha de células e o gene de interesse, e beneficiar de uma janela mais larga de modo a ajustar a expressão de proteínas exógenas com níveis próximos endógenas na maioria de uma população de células de interesse com o mínimo impacto sobre a morfologia celular. Sob tais condições, que também pode alcançar uma elevada eficiência de knockdown da expressão da proteína endógena (> 75%). Pela presente, descrevem o método de passo a passo e fornecem evidências de que a homeostase da proteína não é significativamente perturbados como avaliado pelos níveis inalterados de chaperonas induzidas pelo stress da família de proteínas de choque de calor, tornando o método apropriado para análises funcionais do ro fisiológicole de chaperones moleculares por microscopia de lapso de tempo vídeo. O protocolo é passível de procedimentos de sincronização de células e para a utilização de baculovírus disponíveis comercialmente para a co-expressão de baixos níveis de marcadores fluorescentes, com uma interferência mínima com a dinâmica de actina e do fuso mitótico durante a progressão normais. Mostramos ainda mais a versatilidade do método, que é aplicável a "duro" para transduzir células C2C12 de rato, sem qualquer impacto significativo sobre a diferenciação de mioblastos em miotubos in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, foi descrito um método que permite técnicas de depleção de resgate a ser executada, o que é aplicável para análises funcionais dos processos celulares biológicas que são particularmente sensíveis à sobre-expressão de proteínas que afectam a estequiometria e a dinâmica de complexos de proteínas e estruturas macromoleculares. divisão celular mitótico é um exemplo extremo de morfodinâmica celulares afinado que envolve os mais dramáticos e espetaculares mudanças na estrutura global de uma célula….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
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