Adenofection: שיטה בחקר התפקיד של מלוויהם מולקולריים הסלולרית Morphodynamics ידי ניסויי דלדול-הצלה
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
תהליכים תאיים כגון מיטוזה התמיינות תאים נשלטים על ידי שינויים בצורת תא נשענים ברובם על שיפוץ התקין של מבני cytoskeletal התא. זה כולל את מכלול הפירוק של מבני macromolecular מסדר גבוה בכל זמן נתון ומיקום, תהליך רגיש במיוחד להפרעות הנגרמת על ידי ביטוי יתר של חלבונים. שיטות שיכולים לשמר הומאוסטזיס חלבון ולשמור ליד אל-נורמלי מורפולוגיה הסלולר הן רצויות מאוד לקבוע את התרומה התפקודית של חלבון של עניין במגוון רחב של תהליכים תאיים. דלדול-הצלת חלוף ניסויים מבוססים על התערבות RNA גישות רבות עצמה כדי לנתח פונקציות חלבון ודרישות מבניות. עם זאת, חידוש של חלבון המטרה עם מינימום סטיות מרמתו הפיזיולוגית הוא אתגר אמיתי. כאן אנו מתארים adenofection שיטת כינה אשר פותח כדי ללמוד את התפקיד של מלווים מולקולרייםשותפי ד ב הפעולה הרגילה של תאי מתחלקים ומערכת היחסים עם שיפוץ יקטין. תאי הלה היו מתרוקנים של BAG3 עם דופלקסים siRNA מיקוד באזור 3'UTR. חלבונים BAG3-tagged GFP היו מחדש סימולטנית לאנגלית> 75% של תאים באמצעות adenoviruses רקומביננטי מצמידים את ריאגנטים transfection. Adenofection לאפשר להביע חלבונים BAG3-GFP ברמות פיזיולוגיות ליד בתאים הלה מדולדל של BAG3, בהעדר תגובת הלחץ. אין השפעה נצפתה על הרמות של מלוות חלבון הלם חום אנדוגני, רגולטורי מתח מושרה הראשיים של הומאוסטזיס חלבון. יתר על כן, על ידי הוספת baculoviruses נהיגת הביטוי של סמני ניאון בזמן-transfection התמר תא, נוכל לנתח דינמיקת תא mitotic ידי מיקרוסקופי זמן לשגות מנתח עם הפרעות מינימום של התקדמות mitotic הנורמלית. Adenofection ישימה גם לתאי עכבר שקשה להדביק, ומתאים עבור ניתוחים תפקודיים של diff myoblasterentiation לתוך myotubes. לפיכך adenofection מספק שיטה צדדית לבצע מבנה-תפקוד המנתח של חלבונים מעורבים בתהליכים ביולוגיים רגישים המסתמכים על דינמיקת cytoskeletal מסדר גבוה.
Introduction
איון פונקציונלי של ביטוי גנים בתאי יונקים הוא תקן הזהב לנתח פונקציות חלבון. חדש הטכנולוגיות שפותחו של עריכת הגנום מבוסס על השימוש nucleases באתר ספציפי כגון nucleases אבץ-אצבע התקבצו בקביעות interspaced חזרות palindromic קצר (CRISPR) / CAS9 כעת לאפשר לדור של שורות תאים עם המחיקה הגן ממוקדות מוטציה 1,2. גישות חדשות אלו צריכות לחולל מהפכה באופן שבו אנו לומדים תפקוד חלבון ואת הבנתנו את הגנטיקה של מחלות אנושיות. בחלק מהמקרים, לעומת זאת, לטווח ארוך או נוקאאוט גנטי שלם אינו רצוי ועלול לעורר מנגנוני פיצוי התא המשני. הדור של שורות תאים מהונדסים גנטית יכול להיות גם להגביל כשדנים בתרביות תאים ראשוניים עם קיבולת התפשטות מוגבלת, או כאשר ההקרנה של רשימה ארוכה של מוטציות תאים מסוגים שונים הוא ביקש. זה נדרש לעתים קרובות לקביעת התלות של b התאתהליך iological על דרישות מבניות של חלבון. לשם כך, מציאה הפיכה על ידי התערבות RNA המאפשרת ניסויים-הצלת דלדול חולפים ברקע הסלולר שונה עדיין גישה פשוטה ורב עצמה כדי לבצע מבנה-תפקוד המנתח של חלבון של עניין 3. עם זאת, חסרון עיקרי של גישה זו הוא הקושי להשיג השתקה יעילה לחדש את החלבון של עניין או גרסותיה ברמות הפיזיולוגיות קרובות מוצג רוב אוכלוסיית התא. זה חיוני כדי לאפשר מחקרים מקיפים המנסים לתאם השפעות פונקציונליות לראות ברמה של תאים בודדים (פנוטיפ hypomorphic) לאלו שנראו מבוססי מבחני אוכלוסיית תאים, למשל על אינטראקציות בין חלבונים.
שימוש בשיטות transfection קלסיים, נדמה שאי אפשר להשיג ביטוי הומוגנית ונמוך של חלבונים אקסוגניים אוכלוסייה גדולה של תאים. התמרה של תאים עם וירוסים רקומביננטיכמו adenoviruses מאפשר לעתים קרובות ביטוי מנורמל יותר של חלבונים אקסוגניים. עם זאת, ספיגת אדנווירוס הוא מוגבל על ידי קולטן CAR, אשר נעדר בתאים שאינם בני אדם או רק הביע חלש בחלק סוגי תאים אנושיים. יתר על כן, כניסת הסלולר של adenoviruses מפעילה מסלולי איתות מווסתים 4-6 צורת הידבקות תא. זה כמובן לא רצוי כאשר לומדים מנגנוני ויסות של morphodynamics התא. אנו עומדים בפני בעייתיים הזה כשאנחנו התחייבנו ניתוחים תפקודיים של קומפלקס מלווה, BAG3-HSPB8, חלוקת תא ואת הדינמיקה תקטין. החלוץ לעבוד תיארה תפקיד מורכב המלווה הזה בקרת איכות חלבון autophagy במהלך מתח 7,8. רוב המחקרים האלה, לעומת זאת, הסתמכו על ביטוי יתר של חלבון, בהנחת המלווים הם שהוגברו כרגיל בזמן המתח. זה השאיר פתוח את השאלה של BAG3 אם, בקומפלקס עם HSPB8, יכול לתרום לפעילות התקינה של תאים המתחלקים להביע המלווה אסה כמו סוגים רבים של תאים סרטניים 9. בפרט, אם מורכבי המלווה תורמים השיפוץ של מבנים מבוססים יקטינו השולטים התקדמות mitotic היה עניין רב, בהתחשב הקשרים המתעוררים בין מלווי HSPB ודינמיקת cytoskeletal 10. כדי לטפל בבעיה זו, אנו מחפשים לפתח שיטה יעילה ניסויי דלדול-הצלה שלא תפריע להתקדמות mitotic או מורפולוגיה הסלולר, ואשר שיישמר הומאוסטזיס חלבון כדי למנוע הפרעה משנית של הדינמיקה של מתחמי macromolecular המסדיר שינויים בצורת התא . כך באופן אידיאלי, דלדול-התוספת האחורי של הגן של עניין צריך להתבצע בו זמנית.
השימוש מכלולי אדנו עם פולימר קטיוני או שומנים תואר לקדם העברת גנים במבחנת in vivo 11,12. למשל, סידן פוספט (קאפי) מופיע לגבש משקע עםאדנו-וירוס המשפרים כניסה מחייבת באמצעות מסלול CAR-עצמאי 13. ואכן, מצאנו כי שילוב התמרה מבוסס תאי אדנו ו transfection עם תרכובות קטיוני יכול לשפר את היעילות של ניסויי דלדול-ההצלה. זה אפשר לנו להוריד את הכמויות של נגיף על ידי 3 עד פי 20, בהתאם לקו התא ואת הגן של עניין, ותועלת מחלון רחב יותר על מנת להתאים את הביטוי של חלבונים אקסוגני ברמות אנדוגני קרובות הרוב אוכלוסייה של עניין תא עם השפעה מינימאלית על מורפולוגיה הסלולר. בתנאים כאלה, אנחנו גם יכולים להשיג מציאה יעילה גבוהה של ביטוי חלבון אנדוגני (> 75%). הנם מתארים את שיטת הצעד אחרת צעד ולספק ראיות לכך הומאוסטזיס חלבון אינו מוטרד באופן משמעותי כפי שהוערך על ידי הרמות ללא שינוי של מלוות בעקבות לחץ של מש' חלבון הלם החום, מה שהופך את השיטה מתאימה עבור ניתוחים תפקודיים של ro הפיזיולוגיle של מלווים מולקולריים ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו. הפרוטוקול ניתן נהלי סנכרון תא לשימוש baculoviruses הזמין מסחרי עבור שיתוף ביטוי של רמות הנמוכות של סמני ניאון, עם התערבות מינימאלית עם מבוססים תקטינו נורמלית ודינמיקת הציר במהלך התקדמות mitotic. בנוסף, אנו מציגים את הרבגוניות של שיטה, אשר חל על "קשה transduce" בתאי עכבר C2C12, ללא השפעה משמעותית על בידול myoblast לתוך myotubes במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן תארנו שיטה המאפשרת ניסויי דלדול-הצל להתבצע, אשר חלו על ניתוחים תפקודיים של תהליכים ביולוגיים סלולריים, כי הם רגישים במיוחד ביטוי יתר של חלבונים המשפיעים על והרכב ודינמיקה של קומפלקסי חלבונים ומבני macromolecular. חלוקת תא mitotic היא דוגמא קיצונית של morphodynamics תא מכוון היטב …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
References
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
- Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts. J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).
- Yousuf, M. A., et al. Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells. PLoS One. 8 (10), e77462 (2013).
- Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. Sci Rep. 3, 2889 (2013).
- Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).
- Fuchs, M., et al. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).
- Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2, e141 (2011).
- Guilbert, S. M., Tanguay, R. M., Hightower, L. E., et al. . The Big Book of Small Heat Shock Proteins. , 435-456 (2015).
- Fasbender, A., et al. Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).
- Toyoda, K., et al. Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).
- Fasbender, A., et al. Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).
- Fuchs, M., et al. A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genetics. 11 (10), e1005582 (2015).
- Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Takahashi, A., et al. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).
- Murray, T. V., et al. A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation. J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).
- Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells). Int J Cell Biol. 2013, 616294 (2013).
- Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion. Sci Signal. 6 (272), re2 (2013).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
