Adenofection：枯渇-レスキュー実験によって細胞Morphodynamicsにおける分子シャペロンの役割を研究するための方法
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
このような有糸分裂および細胞分化などの細胞プロセスは、主に細胞の細胞骨格構造の適切な改造に依存している細胞形状の変化によって支配されています。これは、与えられた時間と場所での高次高分子構造の組立・分解、タンパク質の過剰発現によって引き起こされる摂動に特に敏感であるプロセスを含みます。タンパク質恒常性を維持し、周辺対正常な細胞形態を維持することができる方法は、細胞プロセスの広い範囲で、目的のタンパク質の機能的寄与を決定することが非常に望ましいです。 RNA干渉に基づいて、過渡枯渇-レスキュー実験は、タンパク質の機能と構造要件を分析するための強力なアプローチです。しかし、その生理学的レベルからの最小偏差で標的タンパク質の再導入は、本当の挑戦です。ここでは、分子シャペロンの役割を研究するために開発された方法と呼ばれるadenofectionを説明D分裂細胞の正常な動作のパートナーとアクチンリモデリングとの関係。 HeLa細胞は、3'UTR領域を標的とするsiRNA二重鎖とBAG3を枯渇させました。 GFPタグBAG3タンパク質は、トランスフェクション試薬に結合された組換えアデノウイルスを用いた細胞の> 75％の中に同時に再導入しました。 Adenofectionはストレス応答の不存在下で、BAG3枯渇HeLa細胞における近生理学的レベルでBAG3-GFPタンパク質を発現することが可能。効果は、内因性熱ショックタンパク質シャペロン、タンパク質ホメオスタシスの主なストレス誘導性調節因子のレベルで観察されませんでした。さらに、細胞の形質導入、トランスフェクションの時に蛍光マーカーの発現を駆動するバキュロウイルスを追加することによって、我々は、タイムラプス顕微鏡によって有糸分裂細胞動態を分析できた通常の有糸分裂の進行の最小摂動と分析しています。 Adenofectionは、ハードに感染さマウスの細胞にも適用し、筋芽細胞デフの機能解析に適しています筋管にerentiation。したがってadenofection高次の細胞骨格の動態に依存感受性生物学的プロセスに関与するタンパク質の分析構造機能を実行するための多用途の方法を提供します。
Introduction
哺乳動物細胞における遺伝子発現の機能的不活性化は、タンパク質の機能を分析するためのゴールドスタンダードです。新たにこのようなジンクフィンガーヌクレアーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼの使用に基づくゲノム編集の技術を開発し、クラスタ化され、定期的にinterspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）は/ CAS9は現在、標的遺伝子の欠失突然変異1,2を有する細胞株の生成を可能にします。これらの新規のアプローチは、我々は、タンパク質の機能およびヒト疾患の遺伝学の我々の理解を勉強している方法に革命を起こす必要があります。いくつかの例では、しかしながら、長期的または完全な遺伝子ノックアウトは望ましくなく、二次電池の補償機構を誘発することができます。遺伝的に改変された細胞株の生成は、限られた増殖能を有する初代細胞培養物を扱う場合にも制限することができ、または様々な細胞型における変異の大規模なセットのスクリーニングが求められている場合。これは、多くの場合、セルbの依存性を決定するために必要とされますタンパク質の構造要件にiologicalプロセス。そのために、様々な細胞背景の一過性の枯渇、レスキュー実験を可能にするRNA干渉による可逆的ノックダウンは、まだ構造機能が関心3のタンパク質の解析を実行するためにシンプルで強力なアプローチのまま。しかし、このアプローチの主な欠点は困難効率的なサイレンシングを達成するために、細胞集団の大部分の近生理的レベルで目的のタンパク質またはその変異体を再導入することです。これは、タンパク質 – タンパク質相互作用上のインスタンスのために、細胞集団ベースのアッセイに見られるもので、単一細胞（低形質の表現型）のレベルで見られる機能的効果を相関しようとする総合的な研究を可能にすることが重要です。
古典的なトランスフェクション法を使用して、1はほとんどの細胞の大集団での外因性タンパク質の均質かつ低発現を達成することはできません。組換えウイルスによる細胞の形質導入アデノウイルスのように、多くの場合、外因性タンパク質のより多くの正規化された発現を可能にします。しかし、アデノウイルスの取り込みは、非ヒト細胞に存在しないか、または弱くしかいくつかのヒト細胞型において発現されるCAR受容体によって制限されます。さらに、アデノウイルスの細胞侵入は、細胞の形状および接着4-6を制御するシグナル伝達経路を活性化させます。セルmorphodynamicsの調節機構を研究するとき、これは明らかに望ましくありません。我々は細胞分裂とアクチンダイナミクスに、シャペロン複合体、BAG3-HSPB8の機能解析を行ったとき、私たちはこの問題に直面していました。先駆的な仕事はストレス7,8間のタンパク質の品質管理とオートファジーで、このシャペロン複合体の役割を説明していました。これらの研究のほとんどは、しかし、シャペロンは、通常、ストレスの間にアップレギュレートされていると仮定すると、タンパク質の過剰発現に依存していました。これはBAG3は、HSPB8との複合体で、目を発現する分裂細胞の正常な動作に寄与することができるかどうかの質問を開いたままにしています多くの癌細胞タイプ9のようなESEシャペロン。具体的には、シャペロン複合体は、HSPBシャペロンおよび細胞骨格のダイナミクス10との間に新興の接続与えられた非常に興味深いした有糸分裂の進行を制御するアクチンベースの構造のリモデリングに寄与するかどうか。この問題に対処するために、我々は、有糸分裂の進行又は細胞形態を妨害しない、および細胞形状変化を調節する高分子複合体の力学の二次摂動を回避するために、タンパク質恒常性を維持することになる空乏レスキュー実験のための効率的な方法を開発しようとしました。 。このように理想的には、目的の遺伝子の枯渇-追加バックが同時に行われるべきです。
カチオン性ポリマーまたは脂質とアデノウイルスとの複合体の使用は、 インビトロおよびインビボ 11,12 における遺伝子導入を促進するために記載されています。例えば、リン酸カルシウム（CAPI）を、沈殿物を形成するように見えますCAR非依存的経路13を介してウイルス結合エントリを向上させるアデノウイルス。実際、我々は、カチオン性化合物を用いて、アデノウイルスベースの細胞形質導入およびトランスフェクションを組み合わせること枯渇レスキュー実験の効率を高めることができることを見出しました。これは、大部分の近内因性レベルで外因性タンパク質の発現を調節するために細胞株を、目的の遺伝子に応じて、我々は20倍に3によりウイルス量を低下させ、より広い窓から利益細胞形態への影響を最小限に抑えながら、目的の細胞集団の。このような条件下では、我々はまた、内因性タンパク質の発現（> 75％）の高効率ノックダウンを達成することができました。我々はここ生理ROの機能解析のための方法が適して、ステップによって方法ステップを説明し、熱ショックタンパク質ファミリーのストレス誘発シャペロンの不変のレベルによって評価されるようなタンパク質の恒常性が著しく乱されていないという証拠を提供しますタイムラプスビデオ顕微鏡による分子シャペロンのル。プロトコルは、有糸分裂の進行中に、通常のアクチンベースとスピンドルダイナミクスとの干渉が最小で、セル同期手続きへと蛍光マーカーの低レベルの共発現のために市販のバキュロウイルスの使用に適しています。我々はさらに、in vitroで筋管への筋芽細胞分化に有意な影響を与えたマウスC2C12細胞を、「形質導入するためにハード」に適用される方法の汎用性を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、化学量論およびタンパク質複合体と高分子構造の動力学に影響を与えるタンパク質の過剰発現に特に感受性である細胞生物学的過程の機能的分析にも適用可能であるデプレッションレスキュー実験を行うことができる方法を記載しました。有糸分裂細胞分裂は、細胞の全体的な構造の中で最も劇的な壮大な変化を伴う細かく調整された細胞morphodynamicsの極端な例です。細胞イメー?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
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