Adenofection: En metode for å studere rollen for molekylær anstand i Cellular Morphodynamics av Nedbryting-redning Eksperimenter
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
Cellulære prosesser som mitose og celledifferensiering er styrt av endringer i cellen form som i stor grad er avhengige av riktig ombygging av celle cytoskeletal strukturer. Dette innebærer montering-demontering av høyere orden makromolekylære strukturer på et gitt tidspunkt og sted, en prosess som er særlig følsom for forstyrrelser forårsaket av overekspresjon av proteinene. Metoder som kan bevare protein homeostase og opprettholde nær-til-normal cellulær morfologi er meget ønskelige for å bestemme den funksjonelle bidraget av et protein av interesse i et bredt utvalg av cellulære prosesser. Forbigående uttynning-redning eksperimenter basert på RNA interferens er effektive metoder for å analysere protein funksjoner og strukturelle krav. Imidlertid er gjeninnføring av målproteinet med et minimum av avvik fra dens fysiologisk nivå en virkelig utfordring. Her beskriver vi en fremgangsmåte betegnet adenofection som ble utviklet for å studere rollen til molekylære anstand end partnere i normal drift av delende celler og forholdet til aktin ombygging. HeLa-celler ble tømt for BAG3 med siRNA tomannsboliger rettet mot 3'UTR regionen. GFP-merket BAG3 proteiner ble gjeninnføres samtidig til> 75% av cellene ved hjelp av rekombinant adenovirus som er koplet til transfeksjon reagenser. Adenofection i stand til å uttrykke BAG3-GFP-proteiner i nærheten av fysiologiske nivåer i HeLa-celler utarmet av BAG3, i fravær av en stressrespons. Ingen effekt ble observert på nivåer av endogene Heat Shock Protein anstand, de viktigste stress-induserbar regulatorer av protein homeostase. Videre, ved å tilsette baculovirus som driver ekspresjonen av fluorescerende markører på tidspunktet for celle transduksjon-transfeksjon, kan vi dissekere mitotiske celle-dynamikk av time-lapse mikroskopiske analyser med minimal forstyrrelse av normal mitotisk progresjon. Adenofection gjelder også vanskelige å infisere museceller, og egner seg for funksjonelle analyser av myoblast diffdifferensieringen inn myotubes. Dermed adenofection gir en allsidig metode for å utføre struktur-funksjonsanalyser av proteiner som er involvert i følsomme biologiske prosesser som er avhengige av høyere orden cytoskeletal dynamikk.
Introduction
Funksjonell inaktivering av genekspresjon i pattedyrceller er gullstandarden for å dissekere protein funksjoner. Nyutviklet teknologi av genom redigering basert på bruk av stedspesifikke nukleaser som sink-finger nukleaser og gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CAS9 nå tillate dannelsen av cellelinjer med målrettet genet sletting og mutasjon 1,2. Disse nye tilnærminger skal revolusjonere måten vi studerer protein funksjon og vår forståelse av genetikk av menneskelige sykdommer. I noen tilfeller er imidlertid langvarige eller komplette gen knockout ikke ønskelig og kan provosere sekundære celle kompensasjonsmekanismene. Genereringen av genetisk modifiserte cellelinjer kan også være begrensende når håndtere primære cellekulturer med begrenset kapasitet spredning, eller ved screening av et stort sett av mutasjoner i forskjellige celletyper er søkt. Dette er ofte nødvendig for å bestemme avhengigheten av en celle biological prosess på strukturelle krav til et protein. For å nå dette målet, er fortsatt reversible knockdown av RNA-interferens som gjør forbigående utarming-redningsforsøk i ulike cellulære bakgrunn fortsatt en enkel og kraftfull tilnærming til å utføre struktur-funksjonsanalyser av et protein av interesse tre. Imidlertid er en stor ulempe for denne fremgangsmåten er vanskeligheten med å oppnå effektiv lyddemping og for å gjeninnføre den proteinet av interesse eller en av variantene på nær fysiologiske nivåer i et flertall av cellepopulasjonen. Dette er viktig for å muliggjøre omfattende studier som forsøker å korrelere funksjonelle effekter sett i nivå med enkeltceller (hypomorphic fenotype) med de som ses i cellepopulasjonsbaserte analyser, for eksempel på protein-protein-interaksjoner.
Ved hjelp av klassiske transfeksjon metoder, kan man neppe oppnå homogen og lavt uttrykk av eksogene proteiner i en stor populasjon av celler. Transduksjon av celler med rekombinante virussom adenovirus gjør ofte mer normalisert uttrykk for eksogene proteiner. Likevel er adenovirus opptak begrenset av CAR-reseptoren, som er fraværende i ikke-humane celler eller bare svakt uttrykt i visse humane celletyper. Videre den cellulære oppføring av adenoviruses aktiverer signalveier som regulerer celleform og heft 4-6. Dette er åpenbart ikke ønskelig når man studerer reguleringsmekanismer for celle morphodynamics. Vi var overfor dette problematisk når vi foretok funksjonelle analyser av anstand kompleks, BAG3-HSPB8 i celledeling og aktin dynamikk. Pionerarbeid hadde beskrevet en rolle for denne anstand komplekset i protein kvalitetskontroll og autofagi under stress 7,8. De fleste av disse studiene har imidlertid avhengig av protein overekspresjon, forutsatt at anstand normalt oppregulert under stress. Dette har igjen åpne spørsmålet om BAG3, i kompleks med HSPB8, kan bidra til normal drift av delende celler uttrykker thESE anstand som mange kreftcelletyper 9. Spesielt om anstand kompleks bidrar til ombygging av aktin-baserte strukturer som styrer mitotisk progresjon var av stor interesse, gitt de nye forbindelser mellom HSPB anstand og cytoskeletal dynamikk 10. For å løse dette problemet, ble vi søker å utvikle en effektiv metode for uttømming-redning eksperimenter som ikke ville forstyrre mitotisk progresjon eller cellulær morfologi, og som ville bevare protein homeostase for å unngå sekundær forstyrrelse av dynamikken i makromolekylære komplekser som regulerer celle-formen endringer . Således ideelt sett bør uttømming-add-back av genet av interesse bli utført samtidig.
Anvendelsen av komplekser av adenovirus med en kationisk polymer eller lipider er blitt beskrevet for å fremme genoverføring både in vitro og in vivo 11,12. For eksempel, kalsiumfosfat (Capi) ser ut til å danne et bunnfall medadenovirus som forbedrer virus binding-entry via en CAR-uavhengig vei 13. Ja, vi fant at å kombinere adenovirus-baserte celle transduksjon og transfeksjon med kationiske forbindelser kan forbedre effektiviteten av uttømming-redningsforsøk. Dette tillot oss å senke mengden av virus med 3 til 20 ganger, avhengig av cellelinjen og genet av interesse, og dra nytte av et større vindu for å regulere ekspresjon av eksogene proteiner ved i nærheten av endogene nivåer i de fleste av en cellepopulasjon av interesse med minimal innvirkning på mobilnettet morfologi. Under slike forhold, kan vi også oppnå høy virkningsgrad knockdown av endogent protein uttrykk (> 75%). Vi beskriver herved fremgangsmåten trinn for trinn og gir bevis for at proteinet homeostase ikke blir vesentlig forstyrret som vurderes av uendrede nivåer av stress-induserte anstand av varmesjokkprotein familie, noe som gjør fremgangsmåten egnet for funksjonell analyse av fysiologiske role av molekylære anstand av time-lapse video mikroskopi. Protokollen er mottagelig for celle synkroniseringsfremgangsmåter og anvendelse av kommersielt tilgjengelige baculovirus for ko-ekspresjon av lave nivåer av fluorescerende markører, med minimal interferens med normale aktin-baserte og spindel dynamikk i løpet av mitotisk progresjon. Vi viser videre allsidighet av metoden, som er gjeldende for "vanskelig å omsette" muse C2C12 celler, med ingen signifikant innvirkning på myoblast differensiering i myotubes in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskrev vi en fremgangsmåte som muliggjør uttømming-redningsforsøk som skal utføres, noe som er anvendelig for funksjonelle analyser av celle biologiske prosesser som er spesielt følsomme for overekspresjon av proteinene som påvirker støkiometri og dynamikken i proteinkomplekser og makromolekylære strukturer. Mitotisk celledeling er et ekstremt eksempel på finstemt celle morphodynamics som involverer de mest dramatiske og spektakulære endringer i den overordnede strukturen i en celle. Bruke adenofection …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
References
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
- Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts. J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).
- Yousuf, M. A., et al. Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells. PLoS One. 8 (10), e77462 (2013).
- Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. Sci Rep. 3, 2889 (2013).
- Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).
- Fuchs, M., et al. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).
- Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2, e141 (2011).
- Guilbert, S. M., Tanguay, R. M., Hightower, L. E., et al. . The Big Book of Small Heat Shock Proteins. , 435-456 (2015).
- Fasbender, A., et al. Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).
- Toyoda, K., et al. Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).
- Fasbender, A., et al. Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).
- Fuchs, M., et al. A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genetics. 11 (10), e1005582 (2015).
- Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Takahashi, A., et al. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).
- Murray, T. V., et al. A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation. J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).
- Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells). Int J Cell Biol. 2013, 616294 (2013).
- Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion. Sci Signal. 6 (272), re2 (2013).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
