Adenofection: रिक्तीकरण बचाव प्रयोगों द्वारा सेलुलर Morphodynamics में आण्विक chaperones की भूमिका का अध्ययन के लिए एक विधि
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
ऐसे बँटवारा और सेल भेदभाव के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं सेल आकार में परिवर्तन है कि मोटे तौर पर सेल cytoskeletal संरचनाओं के उचित remodeling पर भरोसा द्वारा संचालित होते हैं। यह एक निश्चित समय और स्थान पर उच्च आदेश macromolecular संरचनाओं के विधानसभा disassembly, एक प्रक्रिया है कि विशेष रूप से प्रोटीन की overexpression की वजह से perturbations के प्रति संवेदनशील है शामिल है। तरीके कि प्रोटीन homeostasis को बनाए रखने और पास करने वाली सामान्य सेलुलर आकृति विज्ञान बनाए रख सकते हैं अत्यधिक सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत रेंज में ब्याज की एक प्रोटीन के कार्यात्मक योगदान निर्धारित करने के लिए वांछित हैं। क्षणिक कमी-बचाव शाही सेना के हस्तक्षेप पर आधारित प्रयोगों प्रोटीन कार्यों और संरचनात्मक आवश्यकताओं का विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली दृष्टिकोण हैं। हालांकि, इसकी शारीरिक स्तर से न्यूनतम विचलन के साथ लक्ष्य प्रोटीन के reintroduction एक असली चुनौती है। यहाँ हम एक विधि करार दिया adenofection कि आणविक chaperones की भूमिका का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था का वर्णन एकविभाजित कोशिकाओं के सामान्य संचालन में डी भागीदारों और actin remodeling के साथ संबंध। हेला कोशिकाओं siRNA duplexes 3'UTR क्षेत्र को लक्षित साथ BAG3 के समाप्त हो गया था। GFP टैग BAG3 प्रोटीन अभिकर्मक अभिकर्मकों के लिए मिलकर पुनः संयोजक एडिनोवायरस का उपयोग कोशिकाओं की> 75% में एक साथ पुनः शुरू किया गया। Adenofection, BAG3 के समाप्त हो हेला कोशिकाओं में पास शारीरिक स्तर पर BAG3-GFP प्रोटीन व्यक्त करने के लिए एक तनाव की प्रतिक्रिया के अभाव में सक्षम होना चाहिए। कोई प्रभाव नहीं अंतर्जात गर्मी झटका प्रोटीन chaperones, प्रोटीन homeostasis के मुख्य तनाव inducible नियामकों के स्तर पर मनाया गया। इसके अलावा, सेल पारगमन अभिकर्मक के समय में फ्लोरोसेंट मार्कर की अभिव्यक्ति ड्राइविंग baculoviruses जोड़कर, हम mitotic सेल गतिशीलता समय चूक सूक्ष्म द्वारा काटना सकता है कि सामान्य mitotic प्रगति की न्यूनतम गड़बड़ी के साथ विश्लेषण करती है। Adenofection मुश्किल से संक्रमित माउस कोशिकाओं को भी लागू है, और myoblast रचनाकार के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैmyotubes में erentiation। इस प्रकार adenofection संरचना समारोह संवेदनशील जैविक प्रक्रियाओं है कि उच्च आदेश cytoskeletal गतिशीलता पर भरोसा में शामिल प्रोटीन का विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक बहुमुखी तरीका प्रदान करता है।
Introduction
स्तनधारी कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के कार्यात्मक निष्क्रियता प्रोटीन कार्यों टुकड़े करना स्वर्ण मानक है। नवनियुक्त जीनोम संपादन के प्रौद्योगिकियों जैसे जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ के रूप में साइट विशेष न्युक्लिअसिज़ के उपयोग पर आधारित विकसित की है और नियमित रूप से क्लस्टर interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / CAS9 अब लक्षित जीन विलोपन और उत्परिवर्तन 1,2 के साथ सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं। ये उपन्यास दृष्टिकोण जिस तरह से हम प्रोटीन समारोह और मानव रोगों की आनुवंशिकी के बारे में हमारी समझ का अध्ययन कर रहे क्रांतिकारी बदलाव करना चाहिए। कुछ उदाहरणों में, हालांकि, लंबी अवधि या पूर्ण जीन पीटा वांछनीय नहीं है और माध्यमिक सेल मुआवजा तंत्र उत्तेजित हो सकता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल लाइनों की पीढ़ी भी सीमित जब सीमित प्रसार क्षमता है, या जब विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में म्यूटेशन का एक बड़ा सेट की स्क्रीनिंग की मांग की है साथ प्राथमिक सेल संस्कृतियों के साथ काम हो सकता है। यह अक्सर एक सेल ख की निर्भरता को निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैएक प्रोटीन की संरचनात्मक आवश्यकताओं पर iological प्रक्रिया। कि अंत करने के लिए, आरएनए हस्तक्षेप कि विभिन्न सेलुलर पृष्ठभूमि में क्षणिक कमी-बचाव प्रयोगों के लिए सक्षम बनाता द्वारा प्रतिवर्ती पछाड़ना अभी भी संरचना समारोह ब्याज 3 के एक प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए एक सरल और शक्तिशाली तरीका बनी हुई है। हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए एक बड़ी खामी कठिनाई कुशल मुंह बंद करने को प्राप्त करने और सेल की आबादी का बहुमत में ब्याज या निकट शारीरिक स्तर पर उसके संस्करण के प्रोटीन reintroduce करने के लिए है। इस व्यापक अध्ययन है कि कार्यात्मक सेल जनसंख्या आधारित assays में देखा उन लोगों, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर उदाहरण के लिए साथ एकल कक्षों (hypomorphic phenotype) के स्तर पर देखा प्रभाव सहसंबंधी करने का प्रयास सक्षम करने के लिए महत्वपूर्ण है।
क्लासिक अभिकर्मक तरीकों का उपयोग करना, एक मुश्किल से कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी में exogenous प्रोटीन के समरूप और कम अभिव्यक्ति प्राप्त कर सकते हैं। पुनः संयोजक वायरस के साथ कोशिकाओं के पारगमनadenoviruses की तरह अक्सर exogenous प्रोटीन की अधिक सामान्यीकृत अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है। फिर भी, एडीनोवायरस तेज कार रिसेप्टर, जो गैर मानव कोशिकाओं में अनुपस्थित या केवल दुर्बलता से कुछ मानव प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त की है द्वारा सीमित है। इसके अलावा, adenoviruses के सेलुलर प्रवेश मार्ग है कि विनियमित सेल आकार और आसंजन 4-6 संकेत को सक्रिय करता है। जाहिर है, यह वांछनीय है जब सेल morphodynamics की नियामक तंत्र के अध्ययन नहीं है। हम इस समस्या का सामना कर रहे हैं जब हम एक निगरानी जटिल, BAG3-HSPB8 के कार्यात्मक विश्लेषण चलाया, कोशिका विभाजन और actin गतिशीलता में। अग्रणी काम के तनाव के दौरान प्रोटीन 7.8 गुणवत्ता नियंत्रण और भोजी में इस निगरानी परिसर के लिए एक भूमिका का वर्णन किया था। इन अध्ययनों के सबसे बहरहाल, प्रोटीन overexpression पर भरोसा किया, यह सोचते हैं कि chaperones सामान्य रूप से तनाव के दौरान upregulated रहे हैं। यह खुला HSPB8 के साथ परिसर में चाहे BAG3 का सवाल छोड़ दिया है, वें व्यक्त कोशिकाओं को विभाजित के सामान्य संचालन के लिए योगदान कर सकते हैंकई कैंसर कोशिका प्रकार 9 ese chaperones। विशेष रूप से, निगरानी जटिल actin आधारित संरचनाओं कि mitotic प्रगति बहुत रुचि के नियंत्रण, HSPB chaperones और cytoskeletal गतिशीलता 10 के बीच उभरते कनेक्शन दिए गए के पुनर्गठन के लिए योगदान देता है। इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम कमी-बचाव प्रयोगों के लिए एक कारगर तरीका है कि mitotic प्रगति या सेलुलर आकृति विज्ञान के साथ हस्तक्षेप नहीं होता है, और जो प्रोटीन homeostasis को बनाए रखने सेल आकार में परिवर्तन के विनियमन macromolecular परिसर की गतिशीलता के माध्यमिक गड़बड़ी से बचने के लिए विकसित करने की मांग कर रहे थे । इस प्रकार आदर्श रूप में, ब्याज की जीन की कमी से जोड़-वापस एक साथ किया जाना चाहिए।
एक cationic बहुलक या लिपिड के साथ adenovirus के परिसरों का उपयोग इन विट्रो और इन विवो 11,12 में जीन स्थानांतरण बढ़ावा देने के लिए वर्णित किया गया है। उदाहरण के लिए, कैल्शियम फॉस्फेट (पूंजी) के साथ एक वेग फार्म करने के लिए प्रकट होता हैएडीनोवायरस कि बढ़ाने एक कार स्वतंत्र मार्ग 13 के माध्यम से वायरस बाध्यकारी प्रविष्टि। दरअसल, हमने पाया है कि cationic यौगिकों के साथ एडीनोवायरस आधारित सेल पारगमन और अभिकर्मक के संयोजन कमी-बचाव प्रयोगों की दक्षता में वृद्धि कर सकता है। यह बहुमत में पास अंतर्जात स्तरों पर exogenous प्रोटीन की अभिव्यक्ति को समायोजित करने के लिए हमें 20 गुना करने के लिए 3 से वायरस की मात्रा को कम करने की अनुमति दी है, क्रम में सेल लाइन और ब्याज की जीन, और एक व्यापक खिड़की से लाभ पर निर्भर करता है सेलुलर आकृति विज्ञान पर न्यूनतम प्रभाव के साथ ब्याज की एक सेल की आबादी का। ऐसी परिस्थितियों के अंतर्गत, हम भी अंतर्जात प्रोटीन अभिव्यक्ति (> 75%) की उच्च क्षमता पछाड़ना प्राप्त कर सकता है। हम इसके द्वारा कदम से कदम का वर्णन विधि और सबूत है कि प्रोटीन समस्थिति काफी के रूप में हीट शॉक प्रोटीन परिवार के तनाव प्रेरित chaperones की अपरिवर्तित स्तरों द्वारा मूल्यांकन परेशान नहीं है प्रदान करते हैं, शारीरिक आरओ के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए विधि उपयुक्त बनासमय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा आणविक chaperones की le। प्रोटोकॉल सेल तुल्यकालन प्रक्रियाओं के लिए और mitotic प्रगति के दौरान फ्लोरोसेंट मार्करों के निम्न स्तर, सामान्य actin आधारित और धुरी गतिशीलता के साथ कम से कम हस्तक्षेप के साथ सह-अभिव्यक्ति के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध baculoviruses का उपयोग करने के लिए उत्तरदायी है। हम आगे की विधि है, जो इन विट्रो में myotubes में myoblast भेदभाव पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव के साथ माउस C2C12 कोशिकाओं, "transduce के लिए कड़ी मेहनत" के लिए लागू है की बहुमुखी प्रतिभा दिखा।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम एक विधि को सक्षम करने कमी-बचाव प्रयोगों प्रदर्शन किया जा रहा है, जो सेल जैविक प्रक्रियाओं है कि विशेष रूप से stoichiometry और प्रोटीन परिसरों और macromolecular संरचनाओं की गतिशीलता को प्रभावित करने प्रोटीन की overe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
References
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