Bestimmung des Zetapotentials über Nanoparticle Translokation Geschwindigkeiten durch eine Tunable Nanopore: Die Verwendung von DNA-modifizierten Partikel als Beispiel

Summary

Hier verwenden wir ein Polyurethan abstimmbaren Nanopore in eine resistive Pulserfassungstechnik integriert Nanoteilchen Oberflächenchemie über die Messung der Partikelgeschwindigkeiten Translokation zu charakterisieren, die verwendet werden können, das Zeta-Potential der einzelnen Nanopartikel zu bestimmen.

Abstract

Nanopore Technologien, die zusammen als Resistive Pulssensoren (RPS) bekannt ist, werden verwendet, um Proteine, Moleküle und Nanopartikel zu erkennen, zu quantifizieren und zu charakterisieren. Tunable resistive Pulserkennung (TRPS) ist eine relativ neue Anpassung an RPS, die einen abstimmbaren Poren enthält, die in Echtzeit verändert werden kann. Hier wir TRPS verwenden , um die Translokation Zeiten von DNA-modifizierten Nanopartikel zu überwachen , da sie die abstimmbaren Porenmembran als Funktion der DNA – Konzentration und Struktur (dh einzelsträngig zu doppelsträngiger DNA) durchqueren.

TRPS basiert auf zwei Ag / AgCl Elektroden durch eine elastomere Porenmembran getrennt, die eine stabile Ionenstrom auf ein angelegtes elektrisches Feld aufbaut. Im Gegensatz zu verschiedenen optisch-basierten Partikelcharakterisierung Technologien können TRPS charakterisieren einzelnen Partikel unter einer Probenpopulation, so dass für multimodale Proben mit Leichtigkeit analysiert werden. Hier zeigen wir, Zetapotentialmessungenüber Partikel Translokation Geschwindigkeiten von bekannten Standards und wenden diese Analyten Translokation mal abzutasten, wodurch sich das Zetapotential dieser Analyten zu messen.

Sowie Mittel zeta Potentialwerte Erfassen werden die Proben alle unter Verwendung eines Partikel-by-Teilchen Perspektive zeigen weitere Informationen auf einer gegebenen Probe durch die Probenpopulation Verteilungen, zum Beispiel. Von solchen, zeigt dieses Verfahren Potential in Sensoranwendungen für beide medizinischen und ökologischen Bereich.

Introduction

Funktionalisierte Nanopartikel werden immer beliebter als Biosensoren sowohl in medizinischen und ökologischen Bereich. Die Fähigkeit , eine Nanopartikel der Oberflächenchemie, die mit DNA, beispielsweise zu verändern, erweist sich nützlich für die gezielte Arzneimittelverabreichungssysteme ¹ und Überwachung DNA-Protein – Wechselwirkungen ^2-4. Eine zunehmend verbreitete Nanopartikel Eigenschaft wird in Biotests verwendet und bei der Bereitstellung von Therapeutika ist Superpara ^5. Superparamagnetische Partikel (SPPS) sind äußerst nützlich bei der Identifizierung und spezifischen Analyten aus komplexen Mischungen zu entfernen und kann so mit der einfachen Verwendung eines einzigen Magneten tun. Einmal entfernt, kann der Analyt-gebundenen Teilchen charakterisiert und analysiert werden, für den Zweck geeignet.

Frühere Verfahren verwendet zum Nachweis und zur Charakterisierung von Nanoteilchen umfassen optische Techniken, wie beispielsweise dynamische Lichtstreuung (DLS), die auch als Photonenkorrelationsspektroskopie bekannt. Obwohl ein hallogh Durchsatz Technik wird DLS beschränkt zu sein , eine Mittelungs basierte Technik und bei der Analyse von multimodalen Proben ohne die Zugabe von Spezialsoftware, die größeren Teilchen eine viel dominanter Signal, produzieren einige der kleineren Teilchen völlig unbemerkt ^6,7 zu verlassen. Particle-by-Teilchen sind Charakterisierungstechniken daher wesentlich günstiger Nanopartikel und funktionalisierte Nanopartikel-Systeme zu analysieren.

RPS basierten Technologien basieren auf ein elektrisches Feld an eine Probe Aufbringen und Überwachen des Transportmechanismus der Partikel durch einen synthetischen oder biologischen Nanopore. Eine relativ neue Nanopartikel – Detektion und Charakterisierung Technik basiert auf RPS ist abstimmbaren Widerstandspulserkennung (TRPS) ^16.08. TRPS ist ein Zwei-Elektrodensystem durch ein elastomeres, abstimmbaren Porenmembran getrennt. Abstimmbarer Poren Verfahren ermöglicht Analyten aus einer Reihe von Form ¹⁷ und eine Größe über ihre trans zu messPort-Mechanismen durch die Pore. Abstimmbaren Poren wurden zuvor für die Detektion von kleinen Partikeln (70-95 nm Durchmesser) Herstellung vergleichbare Ergebnisse zu anderen Techniken , wie beispielsweise Transmissionselektronenspektroskopie (TEM) ¹⁰ verwendet. Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, wird ein Ionenstrom beobachtet und als Partikel / Moleküle durch die Poren passieren, sie vorübergehend die Poren blockieren, eine Verringerung der Strom zu verursachen, die als "Blockade Ereignis" definiert werden kann. Jede Blockade Ereignis ist repräsentativ für ein einzelnes Teilchen , so dass jedes Teilchen in einer Probe einzeln auf der Blockade Größe basierend charakterisiert werden kann, Δ Halb Maximum und voller Breite, FWHM, sowie andere Blockade Eigenschaften. Analysieren von einzelnen Teilchen, wie sie durch eine Nanopore passieren ist vorteilhaft für die multimodale Proben als TRPS erfolgreich und effektiv eine Reihe unterscheiden von Partikelgrößen amongst eine einzelne Probe. Tunable resistive Pulserfassungs vervollständigt Größe ^10, Zetapotential ^12,18 und Konzentration ¹⁵ Messungen gleichzeitig in einem einzigen Durchlauf und kann daher noch unterscheiden Proben ähnlich, wenn nicht die gleiche Größe durch ihre Oberflächenladung ^19; ein Vorteil gegenüber alternativen Sizing-Techniken.

Zeta – Potential ist als das elektrostatische Potential an der Scherebene ²⁰ definiert ist , und wird aus Partikelgeschwindigkeiten berechnet , da sie eine Pore ¹⁹ durchqueren. Zeta-Potential-Messungen einzelner Partikel gibt damit einen Einblick in die Translokation Mechanismen und das Verhalten der Nanopartikel-Systemen in Lösung, wertvolle Informationen für die Zukunft von Nanopartikel-Assay-Designs für eine Vielzahl von Anwendungen. Particle-by-Partikelanalyse solcher Art, ermöglicht auch die Verbreitung und Verteilung von Zetapotentialwerte unter einer Stichprobe untersucht werden, um weitere Informationen erlauben on Reaktionskinetik (einzelsträngig zu doppelsträngiger DNA, zum Beispiel) und Partikelstabilitäten in Lösung erreicht werden.

Hier beschreiben wir eine Technik, und charakterisiert Oberflächen sowohl unmodifizierte und DNA-modifizierten SPP erkennt. Das beschriebene Protokoll ist hier anwendbar auf eine Reihe von anorganischen und biologischen Nanopartikel, aber wir demonstrieren das Verfahren DNA-modifizierten Oberflächen aufgrund ihrer breiten Palette von Anwendungen. Die Technik ermöglicht es dem Benutzer, zwischen einzelsträngigen und doppelsträngigen DNA-Ziele auf einer Nanopartikeloberfläche zu unterscheiden, basierend auf Partikel Translokation Geschwindigkeiten durch ein Porensystem und somit deren Zeta-Potentiale.

Protocol

1. Herstellung der Phosphat-gepufferte Saline mit Tween-20 (PBST) Puffer Auflösen einer Tablette PBS (0,01 M Phosphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid, 0,137 M Natriumchlorid, pH 7,4) in 200 ml deionisiertem Wasser (18,2 M & OHgr; cm). Füge 100 & mgr; l (0,05 (v / v)%) Tween-20 in die 200 ml Pufferlösung als Tensid. 2. Vorbereitung Carboxylende Polystyrolteilchengröße Standards Vortexen die Kalibrierungspartikeln für 30 sec vor der Beschallung…

Representative Results

Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Prozesse der magnetischen Reinigung und einer TRPS Messung. A) Beispiel für magnetische Reinigung von Probe mit einer Probe ausgehend enthält überschüssige, nicht gebundene Einfang – Sonde DNA. B) trpS Meßbeispiel i) Partikel durch die Nanopore vorbei und ii) Blockade Ereignis von Teilchen vorübergehend verschließe…

Discussion

Die Berechnung für das Zeta – Potential verwendet , um eine Kalibrierung basierte Methode verwandt von Arjmandi arbeiten et al. ^21. Die Dauer der Translokation von Teilchen, wie sie eine Nanopore durchqueren, als eine Funktion der angelegten Spannung gemessen wird, eine mittlere elektrische Feld und Partikelgeschwindigkeiten über die Gesamtheit eines regelmäßigen konischen Pore verwenden. Die elektrophoretische Mobilität ist die Ableitung von 1 / T in Bezug auf die Spannung (wobei T die Da…

Materials

Phosphate buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 tablet dissolved in 200 mL deionised water to make buffer solution.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles	Bangs Laboratories, US	CPC200	Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1E12 particles/mL, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2E19 C/nm^2.
Streptavidin coated nanoparticles	Ademtech, France	3121	Batch had binding capacity of 4352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1E11 particles/mL.
Biotinylated oligonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCAC TACGCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary – 5'GCCACGCGTAGTGAGGTTTAACCAT3', Middle binding – 5'GTAGTGAGGT3', End binding – 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging – 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano	Izon Science, NZ		Inherent pressure on system of 47 Pa,
Izon Variable Pressure Module (VPM)	Izon Science, NZ		Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 1000 Pa.
Polyurethane nanopore membranes	Izon Science, NZ	NP150	Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch.
Magrack 6	GE Healthcare, UK	28-9489-64
Sonic Bath	Fisher Scientific, UK	10692353	80 Watts
Vortexer	IKA, Germany	0003365000
Rotary Wheel	Labnet International, US	H5500-230 V