調整可能なナノ細孔を介してナノ粒子の転ベロシティを経由してゼータ電位の決意：例として、DNA修飾された粒子を用いました

Summary

ここでは、個々のナノ粒子のゼータ電位を決定するために用いることができる粒子転速度の測定を介してナノ粒子表面化学を特徴づけるために、抵抗パルスセンシング技術に一体化ポリウレタン可変ナノポアを使用します。

Abstract

抵抗パルスセンサ（RPS）と総称ナノポア技術は、検出、定量化、およびタンパク質分子とナノ粒子を特徴付けるために使用されています。調整可能な抵抗パルスセンシング（TRPS）がリアルタイムに変化させることができる調整可能な細孔を組み込んRPSへの比較的最近の適応です。それらは、DNA濃度および構造の関数として調整可能なポアメンブレンを横切るようにここでは、DNA修飾ナノ粒子の移動時間を監視するためにTRPSを使用する（ すなわち 、一本鎖、二本鎖DNAに）。

TRPSは、印加された電界に応じて安定したイオン電流を確立エラストマー細孔膜で分離された2つのAg / AgCl電極、に基づいています。様々な光学ベースの粒子特性評価技術とは異なり、TRPSは、マルチモーダルサンプルを容易に分析することを可能にする、サンプル集団の中で個々の粒子を特徴づけることができます。ここでは、ゼータ電位測定を実証します既知の標準粒子転速度を介して、したがって、それらの分析物のゼータ電位を測定し、その結果、検体転時間をサンプリングするためにこれらを適用します。

同様に、平均ゼータ電位の値を取得するなど、サンプルが全て例えば、サンプル母集団の分布を介して与えられたサンプルについての詳細を示す粒子ごとの粒子の視点を用いて測定されます。そのような中で、この方法は、医療や環境分野の両方のためのセンシングアプリケーション内で可能性を示しています。

Introduction

官能化ナノ粒子は、両方の医療や環境分野におけるバイオセンサーとしてますます人気が高まっています。 DNAと、ナノ粒子の表面の化学的性質を変化させる能力は、例えば、標的化薬物送達システム¹のために有用な証明及びDNAタンパク質相互作用^2-4を監視^しています。バイオアッセイおよび治療薬の送達に利用されてますます一般的ナノ粒子の宿泊施設には、超常⁵です。超常磁性粒子（のSPP）は、複雑な混合物から特定の検体を識別し、除去するのに非常に有用であり、単一の磁石の簡単な使用して行うことができます。一旦除去、分析物結合粒子の特徴及び目的に適合して分析することができます。

ナノ粒子の検出および特徴付けのために使用される従来の方法は、そうでなければ、光子相関分光法として知られているような、動的光散乱（DLS）のような光学技術を含みます。ハイテクが、GHスループット技術は、DLSは、平均に基づく技術であることに制限され、専門のソフトウェアを追加することなくマルチモーダルサンプルを分析する場合、より大きな粒子が^6,7完全に気づか小さな粒子の一部を残して、はるかに支配的な信号を生成します。粒子によって粒子特性評価技術は、ナノ粒子と、官能化ナノ粒子システムを解析することがはるかに有利です。

RPSベースの技術は、試料に電界を印加し、合成または生物学的ナノポアを通って粒子の輸送機構を監視周りに基づいています。 RPSに基づいて、比較的最近のナノ粒子検出および特性評価技術は、波長可変抵抗パルスセンシング^{（TRPS）8-16}です。 TRPSは、エラストマー、調整可能な細孔膜によって分離された2つの電極システムです。形状¹⁷と大きさの範囲の検体は、それらのトランスを介して測定するための調整可能なポア方法が可能に細孔を通してポートメカニズム。調整可能な細孔は、以前に、このような透過電子分光法^（TEM）10のような他の技術に匹敵する結果を生成する小さい粒子（70〜95 nmの直径）の検出のために使用されてきました。電界が印加されると、イオン電流が観測された粒子/分子が細孔を通過するように、それらは、一時的に「遮断事象」と定義することができる電流の減少を引き起こし、細孔をブロックします。試料中の各粒子が封鎖振幅、Δに基づいて個別に特徴づけることができるように、それぞれの遮断イベントは、単一粒子の代表であります 、および全幅半値、FWHM、ならびに他の封鎖特性。 TRPSとしてマルチモーダルサンプルが正常にかつ効果的にアモンのサイズの粒子の範囲を識別することができるために、彼らはナノ細孔を通過する個々の粒子を分析することが有利です単一のサンプルをGST。調整可能な抵抗パルスセンシングは、単一の実行で同時にサイズ^10、ゼータ電位^12,18と濃度¹⁵測定を完了し、したがって、依然として同様のサンプルを区別、そうでない場合は、それらの表面電荷¹⁹によって同じサイズすることができます。代替サイジング技術に勝る利点。

ゼータ電位は、剪断²⁰の面に静電電位として定義され、そしてそれらは、細孔^19を通過^するように粒子速度から算出されます。個々の粒子のゼータ電位測定は、このように転座のメカニズムと溶液中のナノ粒子系、応用範囲のためのナノ粒子アッセイ設計の未来のための貴重な情報の挙動への洞察を提供します。このような性質の粒子によって粒子分析はまた、より多くの情報oを可能にする、探求するサンプル集団の中でゼータ電位値の普及と流通を可能にします溶液中のn個の反応速度論（例えば、二本鎖DNAを一本鎖）と粒子安定性が達成されます。

ここでは、非修飾およびDNA修飾両方SPP面を検出し特徴付ける技術が記載されています。本明細書に記載されたプロトコルは、無機および生物学的ナノ粒子の範囲に適用可能であるが、我々はアプリケーションの彼らの広い範囲のためにDNA修飾された表面を使用して手順を示しています。技術は、ユーザは、このように粒子転位細孔系を介して速度およびそれらのゼータ電位に基づいて、ナノ粒子表面上に一本鎖および二本鎖DNA標的を区別することを可能にします。

Protocol

1.のTween-20（PBST）緩衝液でリン酸緩衝生理食塩水を作ります 200ml中に脱イオン水（18.2MΩセンチ）を一度PBS錠（0.01 Mリン酸緩衝液、0.0027 M塩化カリウム、0.137 M塩化ナトリウム、pH7.4）に溶解します。 界面活性剤として200ミリリットルの緩衝溶液に100μlの（0.05（v / v）の％）のTween-20を追加します。 2.カルボキシルポリスチレン粒子基準の準備粒子…

Representative Results

磁気精製およびTRPS測定の方法の 1 模式図を 図 。 A）過剰な、未結合の捕捉プローブDNAを含む試料で開始サンプルの磁気精製の例。B）TRPS測定例をi）は、粒子がナノポアを通過すると、ii）粒子から製造遮断イベントが一時的に一時的な低下…

Discussion

ゼータ電位の計算はArjmandi らが仕事に関連するキャリブレーションに基づく方法を使用する^。21。それらはナノ細孔を横切るように、粒子の移動の持続時間は、通常、円錐形細孔の全体にわたる平均電界及び粒子速度を使用し、印加電圧の関数として測定されます。電気泳動移動度は、検知ゾーンの長さの二乗、Lを乗じた電圧に対して1 / Tの誘導体（Tは遮断?…

Materials

Phosphate buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 tablet dissolved in 200 mL deionised water to make buffer solution.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles	Bangs Laboratories, US	CPC200	Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1E12 particles/mL, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2E19 C/nm^2.
Streptavidin coated nanoparticles	Ademtech, France	3121	Batch had binding capacity of 4352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1E11 particles/mL.
Biotinylated oligonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCAC TACGCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary – 5'GCCACGCGTAGTGAGGTTTAACCAT3', Middle binding – 5'GTAGTGAGGT3', End binding – 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging – 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano	Izon Science, NZ		Inherent pressure on system of 47 Pa,
Izon Variable Pressure Module (VPM)	Izon Science, NZ		Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 1000 Pa.
Polyurethane nanopore membranes	Izon Science, NZ	NP150	Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch.
Magrack 6	GE Healthcare, UK	28-9489-64
Sonic Bath	Fisher Scientific, UK	10692353	80 Watts
Vortexer	IKA, Germany	0003365000
Rotary Wheel	Labnet International, US	H5500-230 V