Détermination du potentiel Zeta via nanoparticulaires translocation Velocities à travers un accordable Nanopore: Utilisation de particules d'ADN modifié comme un exemple

Summary

Ici, nous utilisons un nanopore accordable en polyuréthane intégré dans une technique de détection d'impulsions résistif pour caractériser les nanoparticules de la chimie de surface par la mesure des vitesses de translocation de particules, qui peut être utilisé pour déterminer le potentiel zéta des nanoparticules individuelles.

Abstract

technologies de Nanopore, connus collectivement comme capteurs de pulsations résistifs (RPS), sont utilisées pour détecter, quantifier et caractériser les protéines, les molécules et les nanoparticules. détection d'impulsion résistive accordable (de TRPS) est une adaptation relativement récente au RPS qui incorpore un pore accordable peut être modifiée en temps réel. Ici, nous utilisons TRPS pour surveiller les temps de translocation des nanoparticules d'ADN modifiées comme ils traversent la membrane poreuse réglable en fonction de la concentration d'ADN et de la structure ( par exemple, simple brin en ADN double brin).

TRPS repose sur deux électrodes Ag / AgCl, séparés par une membrane poreuse en élastomère qui établit un courant ionique stable lors d'un champ électrique appliqué. Contrairement à diverses technologies de caractérisation des particules optiques à base, TRPS peuvent caractériser des particules individuelles dans une population de l'échantillon, ce qui permet pour les échantillons multimodales à analyser avec facilité. Ici, nous démontrons mesures du potentiel zêtavia des vitesses de translocation de particules de normes connues et les appliquer à l'échantillon des temps de translocation analyte, conduisant ainsi à la mesure du potentiel zeta de ces analytes.

En plus d'acquérir des valeurs de potentiel zêta moyennes, les échantillons sont tous mesurés en utilisant une perspective particule par particule présentant plus d'informations sur un échantillon donné par l'échantillon répartition de la population, par exemple. De ce fait, cette méthode démontre un potentiel dans les applications de détection pour les domaines médicaux et environnementaux.

Introduction

nanoparticules fonctionnalisés sont de plus en plus populaire en tant que biocapteurs dans les deux domaines de la médecine et de l'environnement. La possibilité de modifier la chimie de surface d'une nanoparticule, avec de l' ADN, par exemple, se révèle utile pour les systèmes de délivrance de médicaments ciblés ¹ et de suivi des interactions ADN-protéines ^2-4. Une propriété de nanoparticules de plus en plus commun étant utilisé dans des essais biologiques et dans la prestation de produits thérapeutiques est superparamagnétisme ^5. particules superparamagnétiques (SPPS) sont extrêmement utiles pour identifier et éliminer les analytes spécifiques à partir de mélanges complexes et peuvent le faire avec la simple utilisation d'un seul aimant. Une fois enlevés, les particules d'analyte lié peuvent être caractérisés et analysés adaptés à l'usage.

Les procédés antérieurs utilisés pour la détection et la caractérisation des nanoparticules comprennent des techniques optiques telles que la diffusion dynamique de lumière (DLS), autrement connu comme la spectroscopie de corrélation de photons. Bien qu'un saluttechnique de débit gh, DLS est limitée à être une technique basée sur la moyenne et lors de l' analyse des échantillons multimodaux sans ajout de logiciels spécialisés, les plus grosses particules produisent un signal beaucoup plus dominante, laissant certaines des plus petites particules complètement inaperçues ^6,7. Particule par particule techniques de caractérisation sont donc beaucoup plus favorable pour analyser nanoparticule et les systèmes de nanoparticules fonctionnalisés.

technologies basées RPS sont basés sur l'application d'un champ électrique à un échantillon et la surveillance du mécanisme de transport des particules à travers un nanopore synthétique ou biologique. Une technique relativement récente de détection de nanoparticules et la caractérisation basée sur RPS est résistive accordable impulsion de détection (TRPS) ^8-16. TRPS est un système à deux électrodes séparées par une membrane poreuse en élastomère, accordable. Une méthode accordable de pores permet analytes d'une gamme de forme ¹⁷ et la taille à mesurer via leur transdes mécanismes de port à travers les pores. Les pores accordables ont déjà été utilisés pour la détection de petites particules (diamètre 70-95 nm) produisant des résultats comparables à d' autres techniques telles que la spectroscopie électronique à transmission (MET) ^10. Lorsqu'un champ électrique est appliqué, un courant ionique est observé et que des particules / molécules passent à travers les pores, ils bloquent temporairement les pores, ce qui provoque une réduction du courant qui peut être défini comme un «événement de blocage. Chaque événement de blocus est représentatif d'une seule particule de sorte que chaque particule dans un échantillon peut être caractérisé individuellement en fonction de l'ampleur du blocus, Δ Et toute la largeur à mi-hauteur, LMH, ainsi que d' autres propriétés de blocus. L'analyse des particules individuelles lors de leur passage à travers un nanopore est avantageux pour les échantillons multimodales comme TRPS peuvent réussir et efficacement distinguer une gamme de tailles de particules amongst un seul échantillon. Accordable détection d'impulsion résistive complète taille ^10, zeta potentiels ^12,18 et la concentration de ¹⁵ mesures simultanément en une seule opération et peut donc différencier encore des échantillons de semblable, sinon la même taille par leur charge de surface ^19; un avantage par rapport aux techniques de dimensionnement alternatives.

Le potentiel zêta est défini comme étant le potentiel électrostatique au niveau du plan de cisaillement ^20, et elle est calculée à partir des vitesses de particules comme ils traversent un pore ^19. mesures de potentiel Zeta de particules individuelles donne ainsi un aperçu des mécanismes et le comportement des systèmes de nanoparticules en solution, de précieuses informations pour l'avenir des modèles de test de nanoparticules pour une gamme d'applications translocation. analyse de particules par particule de cette nature permet également la diffusion et la distribution des valeurs de potentiel zêta parmi un échantillon de population à explorer, permettant plus d'informations ocinétique n de réaction (simple brin à l'ADN double brin, par exemple) et des stabilités de particules en solution à atteindre.

Ici, nous décrivons une technique qui détecte et caractérise les deux surfaces SPP non modifiées et modifiées par l'ADN. Le protocole décrit ici est applicable à toute une gamme de nanoparticules inorganiques et biologiques, mais nous démontrons la procédure en utilisant des surfaces d'ADN modifiées en raison de leur large éventail d'applications. Cette technique permet à l'utilisateur de distinguer entre les cibles d'ADN simple brin et double brin sur une surface nanoparticulaire, sur la base des vitesses de translocation de particules à travers un système de pores et donc leurs potentiels zêta.

Protocol

1. Faire de la saline tamponnée au phosphate avec du Tween-20 (PBST) Buffer Dissoudre un comprimé de PBS (0,01 M tampon phosphate 0,0027 M de chlorure de potassium, 0,137 M de chlorure de sodium, pH 7,4) dans 200 ml d'eau déminéralisée (18,2 MQ cm). Ajouter 100 ul (0,05 (v / v)%) Tween-20 à la solution tampon de 200 ml en tant que tensio-actif. 2. Préparation des normes de particules Carboxyl Polystyrène Vortexer les particules d'étalonn…

Representative Results

Figure 1. Représentation schématique des procédés de purification magnétique et une mesure de TRPS. A) Exemple de purification magnétique de l' échantillon à partir d'un échantillon contenant un excès, l' ADN de sonde de capture non lié. B) TRPS exemple de mesure i) des particules passant par le nanopore et ii) événement Blockade produite à …

Discussion

Le calcul du potentiel zêta utilisé une méthode basée sur l' étalonnage lié au travail par Arjmandi et al. ^21. La durée de la translocation des particules lorsqu'elles traversent un nanopore est mesurée en fonction de la tension appliquée, en utilisant une vitesse moyenne de champ électrique et de particules sur la totalité d'un pore conique régulière. La mobilité électrophorétique est la dérivée de 1 / T (où T est la durée du blocage) par rapport à la tension, …

Materials

Phosphate buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 tablet dissolved in 200 mL deionised water to make buffer solution.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles	Bangs Laboratories, US	CPC200	Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1E12 particles/mL, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2E19 C/nm^2.
Streptavidin coated nanoparticles	Ademtech, France	3121	Batch had binding capacity of 4352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1E11 particles/mL.
Biotinylated oligonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCAC TACGCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary – 5'GCCACGCGTAGTGAGGTTTAACCAT3', Middle binding – 5'GTAGTGAGGT3', End binding – 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging – 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano	Izon Science, NZ		Inherent pressure on system of 47 Pa,
Izon Variable Pressure Module (VPM)	Izon Science, NZ		Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 1000 Pa.
Polyurethane nanopore membranes	Izon Science, NZ	NP150	Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch.
Magrack 6	GE Healthcare, UK	28-9489-64
Sonic Bath	Fisher Scientific, UK	10692353	80 Watts
Vortexer	IKA, Germany	0003365000
Rotary Wheel	Labnet International, US	H5500-230 V