Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.
During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.
신진 효모의 포자 형성은 감수 분열 (1), 유전자 재조합 2의 메커니즘 (3) 세포 신호에 의해 발전의 제어, 개발 4의 영양 관리, 전사시 염색체 분리의 제어를 포함 생물학의 여러 측면, 통찰력을 제공하기 위해 연구되고있다 개발 5의 규제 및 포자 형성 (6)의 시험. 포자 형성 보호 포자 벽 (6)의 증착에 이어 머더 셀 내의 새로운 멤브레인 구획의 형성을 포함하는 신규 한 세포 분열 이벤트를 포함한다. 포자 세포 검사 이러한 연구들은 상대적으로 효율적인 방식으로 7,8- 약 24 시간에 포자 형성 과정을 거칠 수있는 급속 포자 효모 SK1, 활용. 효모 신진 포자 조건의 최적화는 9-13,이 실험 설명되었지만S는 고체 배지 또는 포자를 배양 튜브 또는 플라스크를 사용하여 수행되는 대규모의 액체 배양 물에서 포자를 조사 하였다.
여기에서 우리는 96 멀티 웰 플레이트 형식으로 효모 포자하는 방법을 설명합니다. 우리는이 방법에 대해, 통기 동기와 효율적인 포자 형성에 중요한 것을 발견하고, 작은 볼륨 멀티 웰 형식으로 충분한 포자 형성을 보장하기 위해 기술을 고안했다. 세포는 높은 처리량 기술과 바둑판 라이브러리 14-16을 사용하여 높은 카피 억제하는 멀티 웰 플레이트 형식 그러한 스크리닝에 최적화 된 시약을 사용하여 스크리닝 될 수 있도록 96- 멀티 웰 플레이트 형식으로 포자 것은 허용한다.
여기에서 우리는 96 멀티 웰 형식으로 SK1 효모를 포자를위한 프로토콜을 제시한다. 폭기는 교반 막대 또는 아니라 각각의 유리 구슬 중 하나의 사용을 필요로 효율적인 포자 형성을위한 열쇠입니다. 세포가 비드 또는 교반 막대 하나없이 진탕 배양기에서 96 멀티 웰 플레이트에 포자 경우, 세포가 효율적으로 sporulate하지 않습니다. 세포가 비드 또는 (교반없이 30 ° C에서 표 1 인에 비해…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH에서 매사추세츠 보스턴 (LSH) 및 R15 GM86805 대학 (LSH)에서 조셉 P. 힐리 보조금에 의해 지원되었다. SMP는 매사추세츠 보스턴 대학에서 사노피 – 젠 자임 원정대에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
rectangular petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |