Эффективная спороношение<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em> В 96-луночные Format

Summary

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Abstract

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Introduction

Спороношение в почкующихся дрожжей было изучено , чтобы дать представление о многих аспектах биологии, в том числе контроль сегрегации хромосом во время мейоза ^1, механизмы генетической рекомбинации ^2, контроль развития клеткой сигнализации ^3, питательная контроль развития ^4, транскрипционный регулирование развития ^5, а также рассмотрение спорообразования ^6. Спорообразование включает новое событие деление клеток , предусматривающий создание новых мембранных отсеков внутри материнской клетки с последующим нанесением защитного споровой стенки ^6. Эти исследования , которые исследуют спорообразующих клеток часто используют быстро спорообразующих штамма дрожжей SK1, который может пройти процесс спорообразования примерно 24 ч в относительно эффективным способом ^7,8. Хотя оптимизация условий спорообразования для почкующихся дрожжей были описаны ^9-13, это экспериментs исследовали споруляции на твердой среде или в более крупных жидких культурах, где споруляция осуществляется с использованием культуры трубок или колб.

Здесь мы опишем метод спорообразующих дрожжей в многоямного формате пластины 96. Мы считаем, что для этого метода, аэрация имеет решающее значение для синхронного и эффективного споруляции, и разработали методы, чтобы обеспечить достаточное количество споруляцию малого объема многоямный формат. Спорообразующих в формате 96 многоямный пластины позволяет клеткам быть подвергнуты скринингу с использованием методов с высокой пропускной способностью и реагенты , оптимизированные для многоямного формата пластины, такой скрининг для высоких супрессоров копирования с использованием черепичную библиотеки ^14-16.

Protocol

1. Подготовка к споруляцией Примечание:. Средства массовой информации , описанные в этом протоколе выполнены с использованием стандартных рецептов и методов 13,17 Таблица 1 дает формулировку 1 л различных носителей , используемых в данном протоколе. <table border=…

Representative Results

Для оценки этого протокола, эффективность споруляции , полученные из спорообразующих клеток в луночные планшеты (как описано выше) по сравнению с клетками спорулированных с использованием больших объемов в колбы (таблица 2). Использование луночные планше?…

Discussion

Здесь мы приводим протокол для спорообразующих SK1 дрожжей в 96 многоямного формате. Аэрация является ключевым фактором для эффективной споруляции, что требует использования либо мешалкой или стеклянного шарика в каждую лунку. Когда клетки спорообразования в 96 многоямного пластины в ш?…

Materials

Nunc 1.3 ml DeepWell Plates	ThermoScientific	260251	Used for sporulation
Nunc 2.0 ml DeepWell plates	ThermoScientific	278743	Used for presporulation growth, step 1.2.3
3 mm glass bead	Fisher	11-312A	Used for sporulation
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12	Fisher	14-511-82	Used for sporulation
96 well frogger	V&P Scientific	VP407	needed for step 1.2
library copier	V&P Scientific	VP381	needed for step 1.2; to be used with the frogger
rectangular petri dish	ThermoScientific	264728	needed for step 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	needed for media
Yeast Extract	BD	212750	needed for media
Bacto Agar	BD	212750	needed for media
Dextrose	Fisher	D16-3	needed for media
Potassium Acetate	Fisher	P171-500	needed for media
Glycerol	Fisher	G33-500	needed for media
Black 96 well glass bottom plate	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	needed for step 2.4