Sporulazione efficiente di<em> Saccharomyces cerevisiae</em> In un pozzetti formato 96

Summary

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Abstract

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Introduction

Sporulazione nel lievito erba è stata studiata per fornire approfondimenti molti aspetti della biologia, compreso il controllo della segregazione cromosomica durante la meiosi ^1, meccanismi di ricombinazione genetica ^2, il controllo dello sviluppo da cellule segnalazione ^3, controllo nutrizionale di sviluppo ^4, il trascrizionale regolazione dello sviluppo ^5, e l'esame di formazione di spore ^6. Formazione di spore include un nuovo evento divisione cellulare coinvolge la formazione di nuovi compartimenti di membrana all'interno della cellula madre seguita dalla deposizione di un muro di spore di protezione ^6. Questi studi che esaminano le cellule sporulanti spesso approfittano della rapida sporulanti ceppo di lievito SK1, che può subire il processo di sporulazione in circa 24 ore in modo relativamente efficiente ^7,8. Anche se l'ottimizzazione delle condizioni di sporulazione per gemmazione di lievito sono state descritte ^9-13, questi esperimentis esaminato sporulazione su mezzi solidi o in colture liquide scala più ampia in cui è effettuata la sporulazione utilizzando tubi di coltura o flaconi.

Qui si descrive un metodo per sporulanti lievito in un formato piatto pozzetti 96. Troviamo che per questo metodo, aerazione è fondamentale per sporulazione sincrona ed efficiente, e hanno ideato tecniche per assicurare sporulazione sufficiente un formato multipozzetto piccolo volume. Sporulanti in un formato 96 pozzetti piatto permette alle cellule di essere sottoposti a screening utilizzando tecniche high-throughput e reagenti ottimizzati per un formato piatto multipozzetto, tale screening per soppressori di alta copia utilizzando una libreria di piastrelle ^14-16.

Protocol

1. Preparazione per Sporulazione Nota:. I media descritti in questo protocollo sono realizzati con ricette e metodi standard di 13,17 La tabella 1 riporta la formulazione per 1 L di vari supporti utilizzati in questo protocollo. <td style="width: 55px;…

Representative Results

Per valutare questo protocollo, efficienze sporulazione ottenuti da sporulanti cellule in piastre a pozzetti multipli (come descritto sopra) sono stati confrontati con cellule sporigeni utilizzando volumi maggiori in beute (Tabella 2). L'uso di piastre a pozzetti multipli non ha raggiunto l'alta efficienza visto quando sporulanti in fiaschi, in cui l'efficienza ~ 80% può essere visto di routine. Sporulanti in piastre a pozzetti multipli con una corrett…

Discussion

Qui vi presentiamo un protocollo per sporulanti SK1 lievito in un formato di pozzetti 96. L'aerazione è la chiave per la sporulazione efficiente, che richiede l'utilizzo della propria ancoretta o una perla di vetro in ogni pozzetto. Quando le cellule sono sporulata in una piastra multipozzetto 96 in un incubatore agitazione senza né una perlina o ancoretta, le cellule non sporulino in modo efficiente. Solo un piccolo aumento dell'efficienza sporulazione è visto quando le cellule sono sporigeni senza né u…

Materials

Nunc 1.3 ml DeepWell Plates	ThermoScientific	260251	Used for sporulation
Nunc 2.0 ml DeepWell plates	ThermoScientific	278743	Used for presporulation growth, step 1.2.3
3 mm glass bead	Fisher	11-312A	Used for sporulation
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12	Fisher	14-511-82	Used for sporulation
96 well frogger	V&P Scientific	VP407	needed for step 1.2
library copier	V&P Scientific	VP381	needed for step 1.2; to be used with the frogger
rectangular petri dish	ThermoScientific	264728	needed for step 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	needed for media
Yeast Extract	BD	212750	needed for media
Bacto Agar	BD	212750	needed for media
Dextrose	Fisher	D16-3	needed for media
Potassium Acetate	Fisher	P171-500	needed for media
Glycerol	Fisher	G33-500	needed for media
Black 96 well glass bottom plate	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	needed for step 2.4