Denne protokol viser, hvordan til at generere fluorescens mærket, genetisk definerede klonede tumorer i Drosophila øje / den antennal fantasiens diske (EAD). Den beskriver, hvordan at dissekere EAD og hjerne fra den tredje stadiums larver og hvordan at behandle dem til at visualisere og kvantificere genekspression ændringer og tumorindtrængen.
Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.
Cancer er en af de mest genetisk heterogen gruppe af sygdomme, hvis forekomst og dødelighed er dramatisk stigende, især blandt ældre verdensplan. Cancer stammer klonalt fra en tumor-initierende celle, der undslipper iboende tumorundertrykkende mekanismer og deler ud af kontrol. Den gradvise ophobning af genetiske læsioner, der kooperativt fremmer vækst, spredning og motilitet, mens hæmme død og differentiering forvandler den indledende godartet tilgroning til en yderst ondartet, metastatisk og dødbringende tumor. Det er blevet klart, at der ud over genetiske ændringer, tumorudvikling kræver ændringer i det omgivende stroma og krydstale mellem tumor og multipel celletyper (f.eks fibroblaster, immun- og endotheliale celler) i dens mikromiljø. Forståelse af de molekylære principper malign transformation, herunder tumor-stroma interaktioner er af stor betydning for at udvikle forebygtion og tidlig screening strategier, samt nye og effektive behandlinger for kræftbekæmpelse metastaser og resistens.
Frugten flyve Drosophila melanogaster er blevet et attraktivt system til kræftforskning 1-4 på grund af sin hurtige generationstid, bemærkelsesværdige bevarelse af signalering knuder mellem fluer og mennesker, begrænset genetiske redundans og rigdom af avancerede genetiske værktøjer, der letter manipulation af næsten enhver gen i et midlertidigt og rumligt begrænset måde. Genetisk definerede tumorer af varierende malignitet kan reproducerbart manipuleret i Drosophila ved indføring GAIN- og tab-af-funktion-mutationer i en undergruppe af stamceller i en ellers vildtype væv ved hjælp af MARCM teknik 5. Den MARCM Værktøjet kombinerer FLP / FRT (FLP rekombinase / FLP Anerkendelse Target) -medieret mitotisk rekombination 6 med FLP-out 7 og Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) 8 målgenekspressionssystemer 9. Med denne metode ekspression af enhver UAS-baserede transgen, herunder onkogen eller fluorescerende protein cDNA'er eller inverterede DNA gentagelser for dsRNA-induceret gene silencing, vil være begrænset til en klon af celler, der har mistet en specifik genetisk locus og et Gal4 repressor grund rekombination (Figur 1A). Klonale plastre markeret med grønt fluorescerende (GFP) eller rød fluorescerende proteiner (f.eks RFP, DsRed, mCherry) kan let spores gennem udvikling, isoleret og analyseret. Vigtigt er det, kan deres adfærd sammenlignes direkte til den hosliggende vildtype væv. Således spørgsmål relevante for cellen autonome og ikke-selvstændige effekter af genetiske læsioner kan nemt undersøges. Svarende til pattedyr, kun kloner, hvor flere onkogene læsioner kombineres blive ondartede i Drosophila og rekapitulere centrale kendetegnende for mammal cancer. De overproliferate, unddrage apoptose, inducerer inflammation, blive udødelig og INVAtende, i sidste ende dræbe værten 10-17.
Her beskriver vi en protokol til at generere genetisk definerede klonede tumorer i øjet / antennal og hjernevæv af Drosophila larver ved hjælp af MARCM teknik. Metoden bygger på en MARCM tester bestand, der udtrykker gær FLP rekombinasen under kontrol af den eyeless forstærker (eyFLP) 18,19. På denne måde, er GFP-mærkede kloner dannet i både peripodial og søjleepitel af EAD og neuroepithelium af hjernen hele embryonale og larvestadier (figur 1A, B og reference 20). Kloner kan let følges indtil voksenalderen som EAD udvikler sig til den voksne øjet, antenne og hoved kapsel mens neuroepithelium giver anledning til neuroblaster, der producerer differentierede optiske lobe neuroner.
For at lette omfattende molekylære, funktionelt og fænotypisk karakterisering af mosaik væv, vi deskriftlærde en protokol til dissektion af EAD og hjerne fra den tredje stadiums larver og skitsere, hvordan at behandle dem for tre forskellige anvendelser: (i) påvisning af transgene fluorescerende journalister og immunfarvning, (ii) kvantificering af tumorindtrængen og (iii) analyse af genekspression ændrer anvendelse af en kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) eller en høj-throughput mRNA sekventering (mRNA-seq) (figur 1C).
Den immunfarvning protokol kan bruges til at visualisere ethvert protein af interesse med et specifikt antistof. Transgene fluorescerende transkriptionelle reportere skabe nem og præcis Spatiotemporal information om aktiviteten af en bestemt signalvej. Celle-linjespecifikke reportere, på den anden side, afspejler kvalitative og kvantitative ændringer i celle populationer i mosaik væv og blandt tumorer af forskellige genotyper. Kvantificering af invasiv adfærd letter sammenligning af tumor malignitet mellem genotypes. Endelig protokollen beskriver indsamling og behandling af mosaik EAD til RNA isolering er velegnet til både små og store downstream applikationer såsom revers transkription efterfulgt af QRT-PCR og genom-dækkende mRNA-seq hhv. De kvalitative og kvantitative data fra disse analyser tilvejebringe nye indsigt i sociale adfærd klonede tumorer. Desuden producerer de et solidt fundament for funktionelle undersøgelser om betydningen af de enkelte gener, genetiske netværk og tumor mikromiljø i forskellige stadier og aspekter af tumorigenese.
De teknikker til at danne genetiske mosaikker i Drosophila er blandt de mest avancerede værktøjer til at analysere og manipulere genfunktion 33. Den eyFLP-MARCM systemet har vist stærke og robuste som den tillader induktionen af visuelt markeret, genetisk definerede kloner i et rumligt begrænset vis, dvs i væv, hvor den eyeless enhancer er aktiv 9,18. Dette er især vigtigt, når flere genetiske læsioner er kombineret i de samme celler. Mens disse meget afvigende pl…
The authors have nothing to disclose.
We thank the Bloomington Stock Center (Bloomington, USA), Dirk Bohmann, Katja Brückner and Istvan Ando for fly stocks, and antibodies. We thank Marek Jindra and Colin Donohoe for comments on the manuscript. This work was supported by the Sofja Kovalevskaja Award to M.U. from the Alexander von Humboldt Foundation and DFG project UH243/1-1 to M.U. from the German Research Foundation.
Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85°C. |
Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50°C and centrifuge 20 min at 5000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20°C. |
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10X PBS and adjust the pH to 7.4 with 1M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20°C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes) |
Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4°C. Used in dilution 1:1000 in PBST. |
Alexa Flour 546 Phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A22283 | Used in dilution 1:500 in PBST. |
Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15mW) and Red Laser diode 635 (20mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents e.g. TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H20 and store at -20°C | |
dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCCTACCAGCTTCAAGATGAC 3' | |
rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CACGTTGTGCACCAGGAACT 3' | |
mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGGGCGACAAGTACTACAAGCTGA 3' | |
mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACGTCTTGCCGTTCTTGTAGGTGA 3' |