De<em> Drosophila</em> Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Summary

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

Abstract

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

Introduction

Kanker is een van de meest genetisch heterogene groep van ziekten, waarvan de incidentie en sterfte neemt drastisch toe, vooral onder ouderen wereldwijd. Cancer afkomstig klonaal uit een tumor-initiërende cel die inherent tumor suppressor mechanismen ontsnapt en verdeelt uit de hand. De geleidelijke toename van de genetische laesies die gezamenlijk het stimuleren van groei, proliferatie en de beweeglijkheid, terwijl het remmen van de dood en differentiatie transformeert de eerste goedaardige begroeiing in een zeer kwaadaardige, metastatische en dodelijke tumor. Gebleken is dat naast genetische veranderingen, tumorprogressie veranderingen nodig in de omliggende stroma en overspraak tussen tumortypes en verschillende celtypes (bijvoorbeeld fibroblasten, immuun- en endotheelcellen) in de micro-omgeving. Het begrijpen van de moleculaire principes die ten grondslag liggen kwaadaardige transformatie, inclusief de tumor-stroma interacties is van groot belang voor de ontwikkeling van Preventie en vroege screeningsstrategieën, alsmede nieuwe en effectieve behandelingen voor kanker en metastase geneesmiddelresistentie bestrijden.

De fruitvlieg Drosophila melanogaster is een aantrekkelijk systeem voor kankeronderzoek ^1-4 dankzij zijn snelle generatie tijd geworden, opmerkelijke behoud van de signalering knooppunten tussen vliegen en de mens, beperkte genetische redundantie en de rijkdom van geavanceerde genetische tools die manipulatie van bijna elk gen in te vergemakkelijken een tijdelijk en ruimtelijk beperkte wijze. Genetische gedefinieerde tumoren van verschillende maligniteit kan reproduceerbaar worden gemanipuleerd in Drosophila door de invoering gain en verlies-van-functie mutaties in een subset van voorlopercellen in een overigens wildtype weefsel met behulp van de techniek MARCM ^5. De MARCM gereedschap combineert FLP / FRT (FLP recombinase / FLP Erkenning Target) gemedieerde mitotische recombinatie ⁶ met FLP-out ⁷ en Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) ⁸ doelwit genexpressiesystemen ^9. Met deze werkwijze expressie van een-UAS gebaseerde transgene, waaronder oncogeen of fluorescerend eiwit cDNA's of geïnverteerde DNA repeats voor dsRNA-geïnduceerde genuitschakeling, wordt beperkt tot een kloon van cellen die een specifieke genetische locus en een Gal4 repressor door recombinatie verloren (Figuur 1A). Klonen plekken gemarkeerd met green fluorescent (GFP) of rood fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld, RFP, DsRed, mCherry) kan eenvoudig worden gevolgd tijdens de ontwikkeling, geïsoleerd en geanalyseerd. Belangrijker is dat hun gedrag rechtstreeks vergeleken met de aangrenzende wildtype weefsel. Zo vragen relevant zijn voor de cel autonome als niet-autonome effecten van genetische laesies kunnen gemakkelijk worden bestudeerd. Soortgelijke zoogdieren, alleen klonen waarin meerdere oncogene laesies combined maligne Drosophila worden en herhalen belangrijkste kenmerken van kankercellen van een zoogdier. Ze overproliferate, ontwijken apoptose, induceren ontsteking, onsterfelijk en Invasive uiteindelijk het doden van de gastheer ^10-17.

Hier beschrijven we een protocol om genetisch bepaald klonale tumoren in het oog / antennaal en hersenweefsel van Drosophila larven te genereren met behulp van de MARCM techniek. De werkwijze berust op een MARCM tester materieel dat de gist FLP recombinase onder de controle van de enhancer ogenloze (eyFLP) ^18,19 uitdrukt. Op deze wijze worden gemerkt GFP klonen gegenereerd in zowel peripodial en cilindrisch epitheel van de EAD en neuro-epitheel van de hersenen tijdens de embryonale en larvale stadia (Figuur 1A, B en referentie ^20). Klonen kunnen eenvoudig worden gevolgd tot volwassenheid als EAD zich ontwikkelt tot de volwassen oog, antenne en het hoofd capsule, terwijl de neuroepithelium aanleiding geeft tot neuroblasts dat gedifferentieerde optische kwab neuronen produceren.

Uitgebreide moleculaire, functionele en fenotypische karakterisering van het mozaïek weefsel, we de te vergemakkelijkenschrijver een protocol voor dissectie van de EAD en hersenen van de derde instar larven en een beschrijving te verwerken voor drie verschillende toepassingen: (i) het opsporen van transgene fluorescente reporters en immunokleuring, (ii) kwantificering van tumor invasiviteit en (iii) analyse van genexpressie verandert met een kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) of high-throughput sequentiebepaling mRNA (mRNA-seq) (Figuur 1C).

De immunokleuring protocol kan worden gebruikt om een ​​eiwit van belang te visualiseren met een specifiek antilichaam. Transgene fluorescerende transcriptionele reporters bieden handige en nauwkeurige tijdruimtelijke gegevens over de activiteit van een bepaalde signaleringsroute. Cel-afstammingslijn specifieke reporters, anderzijds, tijdens kwalitatieve en kwantitatieve veranderingen in celpopulaties binnen de mozaïek weefsel en bij tumoren van verschillende genotypes. Kwantificering van invasieve gedrag maakt de vergelijking van tumor maligniteit tussen genotypes. Ten slotte is het protocol beschrijft inzameling en verwerking van mozaïek EAD voor RNA-isolatie is geschikt voor zowel kleine als grote schaal downstream-toepassingen zoals reverse transcriptie gevolgd door qRT-PCR en genoom-brede mRNA-seq, respectievelijk. De kwalitatieve en kwantitatieve gegevens verkregen uit deze testen leveren nieuwe inzichten in het sociale gedrag van klonale tumoren. Bovendien produceren ze een solide basis voor functionele studies over de rol van individuele genen, genetische netwerken en tumor micro-omgeving in verschillende stadia en aspecten van tumorigenese.

Protocol

LET OP: Dit werk maakt gebruik van de eyFLP1; handeling> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, bad-GAL80 MARCM 82B Green tester lijn 11. De oversteek van de MARCM 82B Green tester maagden om mannetjes van stammen zoals w; UAS-a; UAS-RNAi b, c FRT82B mut genotype zal nageslacht waarin mitotische recombinatie zal optreden tussen de rechter armen van de 3 e homologe chromosomen opleveren. Zo zal klonen homozygoot mutant gen c distaal aan de FRT82B plaats binnen de he…

Representative Results

Om het potentieel van de eyFLP-MARCM techniek om GFP gemerkt stukken gedefinieerde genotypen in Drosophila EAD genereren demonstreren, werden drie klonen geïnduceerd: (1) controle expressie alleen GFP, (2) maligne tumoren tot expressie een oncogene vorm van de kleine G-proteïne Ras (Ras V12) in een achtergrond van homozygote verlies van een tumorsuppressorgen scribble (Scrib 1) en (3) begroeiing maar niet-invasieve ras V12…

Discussion

De technieken voor het genereren van genetische mozaïeken in Drosophila behoren tot de meest verfijnde hulpmiddelen voor het analyseren en manipuleren genfunctie ^33. De eyFLP-MARCM systeem heeft bewezen krachtig en robuust als het laat de inductie van visueel gemarkeerd, genetisch bepaald klonen in een ruimtelijk beperkte wijze, dat wil zeggen, in de weefsels waar de eyeless enhancer actief is ^9,18. Dit is vooral belangrijk wanneer meerdere genetische laesies worden geco…

Materials

Agar	Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany	00262-0500	Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85°C.
Corn syrup	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany	01939
Propionic acid	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6026.1
Cornmeal	ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany	4010155063948
Malt extract	CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany	728985
Soy flour	Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany	1000246441010
Yeast	Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany	210099K
Methyl-4-benzoate/ Nipagin	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	H5501	Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH
Drosophila fly food vials	Kisker Biotech, Steinfurt, Germany	789008
Vial plugs	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002
Drosophila fly food bottles	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	960177
Bottle plugs	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002 S
Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	81381	Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50°C and centrifuge 20 min at 5000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20°C.
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	9002-93-1
Phosphate-buffered saline/ PBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O
PBST			0.1% Triton X-100 in PBS
Paraformaldehyde/ PFA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	158127	4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10X PBS and adjust the pH to 7.4 with 1M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20°C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes)
Bovine Serum Albumin/ BSA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	A3059	Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST
4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335	DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4°C. Used in dilution 1:1000 in PBST.
Alexa Flour 546 Phalloidin	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	A22283	Used in dilution 1:500 in PBST.
Mouse anti-H2 antibody	Kurucz et al., 2003		Used in dilution 1:500 in blocking solution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK	715-175-151	Used in dilution 1:500 in blocking solution
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11295-10
Glass embryo dish (30 mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	E90
Tungsten needles	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	10130-20
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	26018-17
Microscope slides	VWR, Darmstadt, Germany	631-1553
Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser)	VWR, Darmstadt, Germany	631-1336
Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	1076371
Kimtech Science Precision Wipes	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	06-677-70
Dissecting stereomicroscope	Olympus, Hamburg, Germany	SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)
Fluorescent stereomicroscope	Olympus, Hamburg, Germany	SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera	Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.
Confocal microscope	Olympus, Hamburg, Germany	FV1000	Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15mW) and Red Laser diode 635 (20mW). Software: Fluoview 2.1c Software
Drosophila cooled incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany	Sanyo MIR553
Squirt bottle	VWR, Darmstadt, Germany	215-8105
BD Clay Adams Nutator Mixer	VWR, Darmstadt, Germany	15172-203
ELMI Digital Rocking Shaker	VWR, Darmstadt, Germany	DRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent	VWR, Darmstadt, Germany	2302700	The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents e.g. TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596).
Diethyl pyrocarbonate/ DEPC	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	D5758	Dilute DEPC 1:1000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany	15593-031
Chloroform	Merck, Darmstadt, Germany	102445
TURBO DNase (2 U/µl)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	AM2238
Invitrogen UltraPure Glycogen	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany	10-814-010
Sodium acetate trihydrate	VWR, Darmstadt, Germany	27652.232	Prepare a 3M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2
2-Propanol	Merck, Darmstadt, Germany	109634
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany	100983	Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O.
UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	ND-8000
Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	7007103
Experion Automated Electrophoresis Station	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	7007010
SuperScript III Reverse Transcriptase	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	18080044
Oligo d(T) Primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H20 and store at -20°C
dNTP Mixture	Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France	4030	Store aliquots of 25 µl at -20°C
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	1855195
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	170-8882
Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	HSP9601
Microseal 'B' Film	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	MSB1001
rp49 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' TCCTACCAGCTTCAAGATGAC 3'
rp49 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' CACGTTGTGCACCAGGAACT 3'
mmp1 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' AGGGCGACAAGTACTACAAGCTGA 3'
mmp1 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' ACGTCTTGCCGTTCTTGTAGGTGA 3'