los<em> Drosophila</em> Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Summary

Este protocolo se muestra cómo generar tumores clonales fluorescente marcada, genéticamente definidos en el ojo de Drosophila / discos imaginales de las antenas (EAD). En él se describe cómo diseccionar el EAD y el cerebro de la tercera fase larvaria y la forma de procesarlos para visualizar y cuantificar cambios de expresión génica y la invasividad tumoral.

Abstract

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

Introduction

El cáncer representa uno de los grupos más genéticamente heterogéneo de enfermedades, cuya incidencia y la mortalidad está aumentando de manera espectacular, sobre todo entre las personas de edad en todo el mundo. El cáncer se origina por clonación de una célula de iniciación de tumor que se escapa mecanismos supresores de tumores inherente y divide fuera de control. La acumulación gradual de las lesiones genéticas que cooperativamente promueven el crecimiento, la proliferación y la motilidad, mientras que la inhibición de la muerte y la diferenciación transforma el sobrecrecimiento benigno inicial en un tumor altamente maligno, metastásico y mortal. Se ha hecho evidente que además de las alteraciones genéticas, la progresión del tumor requiere cambios en el estroma circundante y diafonía entre los tipos de células tumorales y múltiple (por ejemplo, fibroblastos, células inmunes y endoteliales) en su microambiente. La comprensión de los principios moleculares que subyacen a la transformación maligna, incluyendo las interacciones del tumor-estroma es de gran importancia para el desarrollo de prevencióny las estrategias de detección temprana, así como tratamientos nuevos y efectivos para combatir la metástasis del cáncer y la resistencia a los medicamentos.

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha convertido en un sistema atractivo para la investigación del cáncer de ^1-4 debido a su tiempo de generación rápida, notable conservación de los nodos entre las moscas y los seres humanos, la redundancia genética limitada y la riqueza de herramientas genéticas avanzadas que facilitan la manipulación de casi cualquier gen en la señalización de manera temporal y espacialmente restringida. Tumores genéticamente definidas de malignidad variable pueden ser diseñados de forma reproducible en Drosophila mediante la introducción de ganancia y mutaciones de pérdida de función en un subconjunto de células progenitoras en un tejido de tipo salvaje de otro modo utilizando la técnica MARCM ^5. La herramienta combina MARCM FLP / FRT (FLP recombinasa / FLP del prisma) mediada por recombinación mitótica ⁶ con FLP de salida ⁷ y GAL4 / UAS (Upstream Secuencia de Activación) ⁸ gen dianasistemas de expresión de ^9. Con esta expresión método de cualquier transgén basada en UAS, incluyendo oncogén o ADNc de proteínas fluorescentes o repeticiones de ADN invertidas para el silenciamiento de genes inducido por dsRNA, se restringirá a un clon de células que han perdido un locus genético específico y un represor Gal4 debido a la recombinación (Figura 1A). Parches clonales marcados con fluorescente verde (GFP) o proteínas fluorescentes de color rojo (por ejemplo, RFP, DsRed, mCherry) puede ser fácilmente seguido en todo el desarrollo, aislado y analizado. Es importante destacar que, su comportamiento se puede comparar directamente con el tejido de tipo salvaje adyacente. Por lo tanto, las preguntas pertinentes a los efectos de células autónomas y no autónomas de lesiones genéticas pueden ser estudiadas convenientemente. Al igual que en los mamíferos, sólo los clones en los que las lesiones oncogénicas múltiples se combinan se vuelven malignas en Drosophila y recapitulan características principales de cáncer de mamífero. Ellos overproliferate, evadir la apoptosis, induce la inflamación, se convierten en inmortales y Invasiva, en última instancia, matar al anfitrión ^10-17.

A continuación, se describe un protocolo para generar tumores clonales genéticamente definidos en el tejido ocular / antenal y el cerebro de las larvas de Drosophila utilizando la técnica MARCM. El método se basa en un aparato de ensayo de la MARCM que expresa la recombinasa FLP de levadura bajo el control del potenciador sin ojos (eyFLP) ^18,19. De esta manera, los clones GFP-etiquetados se generan tanto en el epitelio columnar peripodial y de la EAD y el neuroepitelio del cerebro a través de las etapas embrionarias y de larvas (Figura 1A, B y de referencia ^20). Los clones pueden ser fácilmente seguidos hasta la edad adulta como el EAD se desarrolla en el ojo adulto, la antena y la cabeza de la cápsula mientras que el neuroepitelio da lugar a neuroblastos que producen las neuronas del lóbulo óptico diferenciadas.

Para facilitar una amplia caracterización molecular y funcional y fenotípica del tejido de mosaico, que deescriba un protocolo para la disección de la EAD y el cerebro de la tercera estadio las larvas y delinear la forma de procesarlos para tres aplicaciones diferentes: (i) la detección de reporteros fluorescentes transgénicos y la inmunotinción, (ii) la cuantificación de la invasividad tumoral y (iii) el análisis de cambios de expresión génica utilizando una cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) o una secuencia de ARNm de alto rendimiento (mRNA-seq) (Figura 1C).

El protocolo de la inmunotinción se puede utilizar para visualizar cualquier proteína de interés con un anticuerpo específico. Transgénicos reporteros transcripcionales fluorescentes proporcionan información espacio-temporal conveniente y preciso de la actividad de una vía de señalización particular. reporteros específicos de la célula de linaje, por otra parte, reflejan los cambios cualitativos y cuantitativos en las poblaciones de células dentro del tejido de mosaico y entre los tumores de los genotipos distintos. La cuantificación del comportamiento invasivo facilita la comparación de malignidad del tumor entre el genotipos. Por último, el protocolo de descripción de recogida y tratamiento de EAD mosaico para el aislamiento de ARN es adecuado tanto para aplicaciones posteriores a pequeña y gran escala, tales como la transcripción inversa seguida por QRT-PCR y en todo el genoma de mRNA-seq, respectivamente. Los datos cualitativos y cuantitativos obtenidos de estos ensayos proporcionan nuevos conocimientos sobre el comportamiento social de los tumores clonales. Además, producen una base sólida para estudios funcionales sobre el papel de los genes individuales, redes genéticos y microambiente tumoral en diferentes etapas y aspectos de la tumorigénesis.

Protocol

NOTA: En este trabajo se utiliza el eyFLP1; Ley> y +> Gal4, UAS-GFP; Línea probador FRT82B, bañera-GAL80 MARCM 82B Verde 11. Cruzando las vírgenes probador MARCM 82B verde a los machos de las cepas, tales como W; UAS-a; UAS-RNAi b, c FRT82B genotipo mut producirá progenie en la que se producirá la recombinación mitótica entre los brazos derechos de los cromosomas homólogos de 3ª. De esta manera, los clones mutantes homocigotos para el g…

Representative Results

Para demostrar el potencial de la técnica eyFLP-MARCM para generar parches GFP-marcado de los genotipos definidos en Drosophila EAD, se indujeron tres tipos de clones: (1) control que expresa solamente GFP, (2) los tumores malignos que expresan una forma oncogénica de la pequeña G-proteína Ras (Ras V12) en un fondo de la pérdida homocigótica de un garabato gen supresor de tumor (scrib 1), y (3) sobrecrecimiento pero no invasiva r…

Discussion

Las técnicas para generar mosaicos genéticos en Drosophila son algunas de las herramientas más sofisticadas para el análisis y la manipulación de la función del gen ^33. El sistema eyFLP-MARCM ha demostrado potente y robusto, ya que permite la inducción de, clones genéticamente definidos marcados visualmente de una manera restringida espacialmente, es decir, en los tejidos donde el potenciador sin ojos está activo ^9,18. Esto es particularmente importante cuando la…

Materials

Agar	Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany	00262-0500	Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85°C.
Corn syrup	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany	01939
Propionic acid	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6026.1
Cornmeal	ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany	4010155063948
Malt extract	CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany	728985
Soy flour	Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany	1000246441010
Yeast	Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany	210099K
Methyl-4-benzoate/ Nipagin	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	H5501	Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH
Drosophila fly food vials	Kisker Biotech, Steinfurt, Germany	789008
Vial plugs	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002
Drosophila fly food bottles	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	960177
Bottle plugs	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002 S
Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	81381	Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50°C and centrifuge 20 min at 5000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20°C.
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	9002-93-1
Phosphate-buffered saline/ PBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O
PBST			0.1% Triton X-100 in PBS
Paraformaldehyde/ PFA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	158127	4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10X PBS and adjust the pH to 7.4 with 1M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20°C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes)
Bovine Serum Albumin/ BSA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	A3059	Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST
4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335	DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4°C. Used in dilution 1:1000 in PBST.
Alexa Flour 546 Phalloidin	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	A22283	Used in dilution 1:500 in PBST.
Mouse anti-H2 antibody	Kurucz et al., 2003		Used in dilution 1:500 in blocking solution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK	715-175-151	Used in dilution 1:500 in blocking solution
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11295-10
Glass embryo dish (30 mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	E90
Tungsten needles	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	10130-20
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	26018-17
Microscope slides	VWR, Darmstadt, Germany	631-1553
Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser)	VWR, Darmstadt, Germany	631-1336
Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	1076371
Kimtech Science Precision Wipes	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	06-677-70
Dissecting stereomicroscope	Olympus, Hamburg, Germany	SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)
Fluorescent stereomicroscope	Olympus, Hamburg, Germany	SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera	Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.
Confocal microscope	Olympus, Hamburg, Germany	FV1000	Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15mW) and Red Laser diode 635 (20mW). Software: Fluoview 2.1c Software
Drosophila cooled incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany	Sanyo MIR553
Squirt bottle	VWR, Darmstadt, Germany	215-8105
BD Clay Adams Nutator Mixer	VWR, Darmstadt, Germany	15172-203
ELMI Digital Rocking Shaker	VWR, Darmstadt, Germany	DRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent	VWR, Darmstadt, Germany	2302700	The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents e.g. TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596).
Diethyl pyrocarbonate/ DEPC	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	D5758	Dilute DEPC 1:1000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany	15593-031
Chloroform	Merck, Darmstadt, Germany	102445
TURBO DNase (2 U/µl)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	AM2238
Invitrogen UltraPure Glycogen	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany	10-814-010
Sodium acetate trihydrate	VWR, Darmstadt, Germany	27652.232	Prepare a 3M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2
2-Propanol	Merck, Darmstadt, Germany	109634
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany	100983	Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O.
UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	ND-8000
Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	7007103
Experion Automated Electrophoresis Station	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	7007010
SuperScript III Reverse Transcriptase	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	18080044
Oligo d(T) Primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H20 and store at -20°C
dNTP Mixture	Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France	4030	Store aliquots of 25 µl at -20°C
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	1855195
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	170-8882
Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	HSP9601
Microseal 'B' Film	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	MSB1001
rp49 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' TCCTACCAGCTTCAAGATGAC 3'
rp49 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' CACGTTGTGCACCAGGAACT 3'
mmp1 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' AGGGCGACAAGTACTACAAGCTGA 3'
mmp1 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' ACGTCTTGCCGTTCTTGTAGGTGA 3'