Das<em> Drosophila</em> Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Summary

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Abstract

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

Introduction

Krebs stellt eine der genetisch heterogene Gruppe von Krankheiten, deren Häufigkeit und Sterblichkeit dramatisch zunimmt, insbesondere bei älteren Menschen weltweit. Krebs stammt klonal aus einem Tumor-initiierende Zelle, die inhärente Tumorsuppressor Mechanismen entweicht und teilt außer Kontrolle. Die allmähliche Ansammlung von genetischen Läsionen, die kooperativ Wachstum, die Vermehrung und Beweglichkeit fördern, während der Tod und die Differenzierung Hemmung verwandelt die anfängliche gutartige Wucherung in eine hochmaligne, metastasiertem und tödlichen Tumor. Es hat sich gezeigt, dass zusätzlich zu genetischen Veränderungen, die Tumorprogression Veränderungen im umgebenden Stroma und Übersprechen zwischen den Tumor und mehrere Zelltypen (beispielsweise Fibroblasten, Immun- und Endothelzellen) in seiner Mikroumgebung erfordert. die molekularen Prinzipien zugrunde liegenden malignen Transformation einschließlich Tumor-Stroma-Interaktionen zu verstehen, ist von großer Bedeutung für die Entwicklung von prevention und frühen Screening-Strategien, sowie neue und wirksame Behandlungen von Krebsmetastasen und Medikamentenresistenz zu bekämpfen.

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein attraktives System für die Krebsforschung geworden ^1-4 seiner schnellen Generationszeit wegen bemerkenswerte Erhaltung der Knoten zwischen Fliegen und Menschen, begrenzte genetische Redundanz und Fülle von fortgeschrittenen genetischen Werkzeugen , Signalisierung , die Manipulation von fast jedem Gen erleichtern ein temporär und räumlich beschränkten Weise. Genetisch definierte Tumoren unterschiedlicher Malignität reproduzierbar in Drosophila konstruiert werden durch Verstärkungs- und loss-of-function Mutationen in einer Untergruppe von Vorläufern in einem ansonsten Wildtyp – Gewebe unter Verwendung der MARCM Technik ⁵ einzuführen. Das MARCM Werkzeug kombiniert FLP / FRT (FLP – Rekombinase / FLP Recognition Target) -vermittelten mitotische Rekombination ⁶ mit FLP-out ⁷ und Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) ⁸ ZielgenExpressionssysteme ^9. Mit dieser Methode Expression jedes UAS-basierten Transgen, einschließlich Onkogen oder fluoreszierendes Protein cDNAs oder invertierte DNA-Wiederholungen für dsRNA-induced gene silencing, wird auf einen Klon von Zellen beschränkt werden, die einen bestimmten genetischen Locus und einen Gal4 Repressor aufgrund Rekombination verloren (1A). Geklonte Patches mit grün fluoreszierenden markiert (GFP) oder rot fluoreszierende Proteine (zB RFP, DsRed, mCherry) leicht während der gesamten Entwicklung, isoliert und analysiert verfolgt werden. Wichtig ist, dass ihr Verhalten direkt zum benachbarten Wildtyp-Gewebe verglichen werden. So relevante Fragen an die Zelle autonomen und nicht autonomen Auswirkungen der genetischen Läsionen können bequem untersucht werden. Ähnlich wie bei Säugetieren, nur Klone , bei denen mehrere onkogene Läsionen in Drosophila maligne kombiniert werden und die wichtigsten Merkmale von Säugetierkrebs rekapitulieren. Sie overproliferate, entziehen Apoptose induzieren Entzündung, unsterblich geworden und invasive und tötete schließlich den Host – ^10-17.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung genetisch definierten klonale Tumoren im Auge / antennal und Hirngewebe von Drosophila – Larven der MARCM Technik. Das Verfahren beruht auf einem MARCM Tester Lager, das die Hefe FLP – Rekombinase unter der Kontrolle des eyeless Enhancer (eyFLP) ^18,19 zum Ausdruck bringt. Auf diese Weise GFP-markierten Klone werden erzeugt sowohl in peripodial und Epithel des EAD und dem Neuroepithel des Gehirns gesamten embryonalen und Larvenstadien (1A, B und Referenz ^20). Die Klone können leicht bis zum Erwachsenenalter verfolgt werden, wie der EAD entwickelt sich zum erwachsenen Auge, Antenne und Kopfkapsel während der neuroepithelium Aufstieg zu Neuroblasten gibt, die differenzierte Optik lobe Neuronen erzeugen.

Zur Erleichterung der umfangreiche molekulare, funktionelle und phänotypische Charakterisierung des Mosaiks Gewebe, wir deSchreiber ein Protokoll für die Präparation des EAD und Gehirn von der dritten Larvenstadium und beschreiben, wie sie für drei verschiedene Anwendungen zu verarbeiten: (i) Nachweis von transgenen fluoreszierenden Reporter und Immunfärbung, (ii) die Quantifizierung der Tumor Invasivität und (iii) Analyse Veränderungen der Genexpression eine quantitative Echtzeit – PCR (qRT-PCR) oder ein Hochdurchsatz – Sequenzierung mRNA (mRNA-seq) (1C) verwendet wird .

Die Immunofärbung Protokoll kann jedes Protein von Interesse mit einem spezifischen Antikörper zu visualisieren verwendet werden. Transgene fluoreszierende Transkriptions Reporter ermöglicht eine bequeme und präzise räumlich-zeitliche Informationen über die Aktivität eines bestimmten Signalwegs. Zell-Abstammungslinie spezifischen Reportern, andererseits widerspiegeln qualitative und quantitative Veränderungen in Zellpopulationen im mosaic Gewebe und unter Tumoren von unterschiedlichen Genotypen. Die Quantifizierung von invasiven Verhalten erleichtert den Vergleich von Tumor Malignität zwischen Genotyps. Schließlich ist das Protokoll beschreibt, Erfassung und Verarbeitung von Mosaik EAD für die RNA-Isolierung eignet sich sowohl für kleine und große Downstream-Anwendungen wie Reverse Transkription, gefolgt von qRT-PCR und genomweite mRNA-seq sind. Die qualitativen und quantitativen Daten aus diesen Tests gewonnenen Ergebnisse liefern neue Einblicke in das soziale Verhalten von klonalen Tumoren. Außerdem produzieren sie eine solide Grundlage für funktionelle Untersuchungen über die Rolle einzelner Gene, genetische Netzwerke und Tumor-Mikroumgebung in verschiedenen Phasen und Aspekte der Tumorentstehung.

Protocol

HINWEIS: Diese Arbeit nutzt die eyFLP1; act> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, wannen Gal80 MARCM 82B Grüne Tester Linie 11. Quer durch die MARCM 82B Grüne Tester Jungfrauen zu Männern von Stämmen wie w; UAS-a; UAS-b RNAi, FRT82B c mut Genotyp nachgeben Nachkommen , in der mitotischen Rekombination zwischen den rechten Arm der 3. homologen Chromosomen auftreten. Auf diese Weise homozygoten mutanten Klone zur Gen – c zur FRT82B Stelle distal angeordnet wird…

Representative Results

GFP-markierten Flecken von definierten Genotypen in Drosophila EAD, drei Arten von Klonen , um das Potential der eyFLP-MARCM Technik zeigen , wurden zu erzeugen induziert: (1) Kontrolle, die GFP allein, (2) maligne Tumore eine onkogene Form des kleinen exprimierenden G-Protein Ras (Ras V12) in einem Hintergrund von homozygoten Verlust eines Gens scribble Tumorsuppressor (Scrib 1) und (3) Bewachsen aber nicht-invasive Scrib 1…

Discussion

Die Techniken der genetischen Mosaiken in Drosophila zu erzeugen , gehören zu den anspruchsvollsten Werkzeuge für die Analyse und die Genfunktion ³³ zu manipulieren. Das eyFLP-MARCM System leistungsfähig und robust erwiesen , da sie die Induktion von visuell markiert, genetisch definierte Klone in einer räumlich beschränkten Weise ermöglicht, also in Geweben , in denen die augenlose Enhancer aktiv ^9,18 ist. Dies ist besonders wichtig, wenn mehrere genetische Läsion…

Materials

Agar	Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany	00262-0500	Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85°C.
Corn syrup	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany	01939
Propionic acid	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6026.1
Cornmeal	ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany	4010155063948
Malt extract	CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany	728985
Soy flour	Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany	1000246441010
Yeast	Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany	210099K
Methyl-4-benzoate/ Nipagin	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	H5501	Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH
Drosophila fly food vials	Kisker Biotech, Steinfurt, Germany	789008
Vial plugs	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002
Drosophila fly food bottles	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	960177
Bottle plugs	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002 S
Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	81381	Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50°C and centrifuge 20 min at 5000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20°C.
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	9002-93-1
Phosphate-buffered saline/ PBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O
PBST			0.1% Triton X-100 in PBS
Paraformaldehyde/ PFA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	158127	4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10X PBS and adjust the pH to 7.4 with 1M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20°C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes)
Bovine Serum Albumin/ BSA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	A3059	Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST
4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335	DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4°C. Used in dilution 1:1000 in PBST.
Alexa Flour 546 Phalloidin	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	A22283	Used in dilution 1:500 in PBST.
Mouse anti-H2 antibody	Kurucz et al., 2003		Used in dilution 1:500 in blocking solution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK	715-175-151	Used in dilution 1:500 in blocking solution
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11295-10
Glass embryo dish (30 mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	E90
Tungsten needles	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	10130-20
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	26018-17
Microscope slides	VWR, Darmstadt, Germany	631-1553
Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser)	VWR, Darmstadt, Germany	631-1336
Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	1076371
Kimtech Science Precision Wipes	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	06-677-70
Dissecting stereomicroscope	Olympus, Hamburg, Germany	SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)
Fluorescent stereomicroscope	Olympus, Hamburg, Germany	SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera	Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.
Confocal microscope	Olympus, Hamburg, Germany	FV1000	Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15mW) and Red Laser diode 635 (20mW). Software: Fluoview 2.1c Software
Drosophila cooled incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany	Sanyo MIR553
Squirt bottle	VWR, Darmstadt, Germany	215-8105
BD Clay Adams Nutator Mixer	VWR, Darmstadt, Germany	15172-203
ELMI Digital Rocking Shaker	VWR, Darmstadt, Germany	DRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent	VWR, Darmstadt, Germany	2302700	The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents e.g. TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596).
Diethyl pyrocarbonate/ DEPC	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	D5758	Dilute DEPC 1:1000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany	15593-031
Chloroform	Merck, Darmstadt, Germany	102445
TURBO DNase (2 U/µl)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	AM2238
Invitrogen UltraPure Glycogen	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany	10-814-010
Sodium acetate trihydrate	VWR, Darmstadt, Germany	27652.232	Prepare a 3M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2
2-Propanol	Merck, Darmstadt, Germany	109634
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany	100983	Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O.
UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	ND-8000
Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	7007103
Experion Automated Electrophoresis Station	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	7007010
SuperScript III Reverse Transcriptase	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	18080044
Oligo d(T) Primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H20 and store at -20°C
dNTP Mixture	Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France	4030	Store aliquots of 25 µl at -20°C
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	1855195
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	170-8882
Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	HSP9601
Microseal 'B' Film	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany	MSB1001
rp49 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' TCCTACCAGCTTCAAGATGAC 3'
rp49 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' CACGTTGTGCACCAGGAACT 3'
mmp1 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' AGGGCGACAAGTACTACAAGCTGA 3'
mmp1 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' ACGTCTTGCCGTTCTTGTAGGTGA 3'