Summary
このプロトコルは、 ショウジョウバエの眼/触角成虫（EAD）に蛍光マークされ、遺伝的に定義されたクローンの腫瘍を生成する方法を示します。なお、第3齢幼虫とどのように遺伝子発現の変化と腫瘍侵襲性を可視化し、定量化するためにそれらを処理するからEADと脳を分析する方法について説明します。
Introduction
がんは発症率と死亡率の劇的全世界、特に高齢者の間で、増加している疾患の最も遺伝的に不均質なグループの1つを表します。がんは、固有の腫瘍抑制メカニズムを脱出し、制御不能に分割し、腫瘍開始細胞からクローン由来します。死と分化を抑制しつつ、協働の成長、増殖および運動性を促進する遺伝子病変の段階的な蓄積は非常に、悪性の転移性と致命的な腫瘍に初期良性の異常増殖を変換します。これは、遺伝的変化に加えて、腫瘍の進行は、その微小環境における腫瘍と複数の細胞型（ 例えば 、線維芽細胞、免疫細胞および内皮細胞）の間、周囲の間質とのクロストークの変化を必要とすることが明らかになりました。腫瘍 - 間質相互作用を含む悪性形質転換の根底にある分子の原則を理解することはプリベンを開発するために非常に重要です化と早期スクリーニング戦略だけでなく、癌の転移と薬剤耐性に対抗するための新しい効果的な治療法。
フルーツフライキイロショウジョウバエは、その高速な世代時間に起因する癌研究1-4のための魅力的なシステム、ハエと人間の間のノードのシグナリング顕著保全、のほぼすべての遺伝子の操作を容易に高度な遺伝子ツールの限られた遺伝的冗長性と豊富になってきています一時的および空間的に制限された方法。変化する悪性腫瘍の遺伝的に定義された腫瘍が再現MARCM技術5を用いて、そうでなければ、野生型組織における前駆細胞のサブセットにおいてgain-及び機能喪失変異を導入することにより、ショウジョウバエで操作することができます。 MARCMツールは、FLP / FRT（FLPリコンビナーゼ/ FLP認識ターゲット）はFLPアウト7およびGAL4 / UAS（上流活性化配列）8標的遺伝子との有糸分裂組換え6を媒介組み合わせ発現系9。 dsRNAを誘導される遺伝子サイレンシングのための癌遺伝子または蛍光タンパク質のcDNAまたは反転DNA反復を含む任意のUASベースの導入遺伝子のこのメソッド式で、特定の遺伝子座と組み換えによるGal4のリプレッサーを失った細胞のクローンに制限されます（ 図1A）。クローンパッチは緑色蛍光（GFP）または赤色蛍光タンパク質でマークされた（ 例えば、RFP、DsRedを、mCherryを）を容易に開発し、単離し、分析を通じて追跡することができます。重要なことには、それらの動作は、直接隣接し、野生型組織と比較することができます。このように、遺伝的病変の細胞自律的かつ非自律的効果に関連する質問が便利に研究することができます。哺乳動物に類似し、唯一の複数の発癌性病変が組み合わされたクローンは、 ショウジョウバエにおいて、悪性になると、哺乳動物の癌の主要な特徴を再現します。彼らは、アポトーシスを回避炎症を誘発し、不滅とINVAになり、過剰に増殖しますSIVEは、最終的にホスト10-17を殺します。
ここでは、MARCM技術を用いたショウジョウバエの幼虫の目/触角と脳組織に遺伝学的に定義されたクローン性腫瘍を生成するためのプロトコルについて説明します。この方法は、 アイレスエンハンサー（eyFLP）18,19の制御下で酵母FLPリコンビナーゼを発現するMARCMテスター株に依存しています。このように、GFP標識クローンはperipodial柱状EADの上皮および胚および幼生期（ 図1A、Bおよび参照20）を通じて、脳の神経上皮の両方で生成されます。神経上皮が差別視葉ニューロンを産生する神経芽細胞を生じさせるながらEADは、大人の目、アンテナと頭部カプセルに発展するにつれクローンは、簡単に成人期まで続くことができます。
モザイク組織の大規模な、分子の機能的および表現型の特徴付けを容易にするために、我々デスクライブ3齢幼虫からEADと脳の解剖のためのプロトコルは、3つの異なるアプリケーションのためにそれらを処理する方法を示しています。（ⅰ）トランスジェニック蛍光レポーターおよび免疫染色の検出、腫瘍侵襲性との（iii）の分析の（ii）の定量化遺伝子発現は、定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）またはハイスループットのmRNA配列（mRNAの-SEQ）（ 図1C）を用いて変更します。
免疫プロトコルは、特定の抗体と目的の任意のタンパク質を可視化するために使用することができます。トランスジェニック蛍光の転写レポーターは、特定のシグナル伝達経路の活性に便利で正確な時空間情報を提供します。細胞系統特異的レポーターは、他の一方で、モザイク組織内および個別の遺伝子型の腫瘍のうち、細胞集団における定性的および定量的変化を反映します。侵襲的な行動の定量化は、遺伝子型間の腫瘍の悪性度の比較が容易秒。最後に、RNA単離のためにモザイクEADの収集と処理を説明するプロトコルは、それぞれ定量RT-PCRおよびゲノムワイドのmRNA-seqの、続いて逆転写などの小型の両方大規模なダウンストリームアプリケーションに適しています。これらのアッセイから得られた定性的および定量的なデータは、クローン性腫瘍の社会的行動への新たな洞察を提供します。さらに、それらは個々の遺伝子、遺伝子ネットワークと異なる段階における腫瘍微小環境と腫瘍形成の側面の役割に関する機能研究のための強固な基盤を作り出します。
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Protocol
注：この作品はeyFLP1を利用します。行為> Y +>のGal4、UAS-GFP; FRT82B、浴槽-GAL80 MARCM 82Bグリーンテスターライン11。 W等の菌株の男性にMARCM 82Bグリーンテスターの処女を渡ります。 UAS-; UAS-B のRNAi、FRT82B CのMUT遺伝子型は、有糸分裂組換えが第3相同染色体の右アームの間に生じるであろうに子孫を得られます。このようにして、FRT82B部位の遠位に位置する遺伝子Cのクローンホモ接合変異体は、EADおよび脳神経上皮内で生成されます。これらのクローンは、遺伝子B（ 図1A）のためのGFP導入遺伝子AとのdsRNAを発現します。 X、2L、2R、3L及び3R上の組換えのための様々なeyFLP-MARCMテスターラインが確立され、ハエのコミュニティ内で使用可能なされています。
1.フライ処理、十字架、およびステージング
- 複数のBOを取り込むことによって、室温で適切なMARCMテスター在庫を展開同時にttles。十分な処女は、その後の交配のために収集することができるように、2〜3日ごとに新鮮なボトルに大人を反転します。
注：処女を収集する場合、これは女性の生殖能力を損なうとして、CO 2への長期暴露を避けます。 - 実験の規模に応じて、少なくとも10 MARCMテスター処女と（ 例えば 、蛍光レポーターおよび免疫染色のイメージングのため）、または少なくとも30処女と10人の男性（ 例えば 、用とボトルで4人の男性を使用してバイアル内のフライ十字架を設定侵襲性のRNAの単離および定量化）。
- 長い一日16時間/ 8時間の明暗サイクル下、25℃で子孫を上げます。幼虫の再現可能なステージングを容易にし、過密を防止するために、新しいバイアル/ボトルに24時間毎に両親を反転します。
注：卵は産卵後6日目に開始（AEL）、後期3齢制御幼虫停止送り、徘徊開始とpupariationを入力してください。これとは対照的に、幼虫、蛹遷移の開始は解除することができますEADは、過形成性または悪性クローン性腫瘍を担持して幼虫にレイアウトさまたは存在しません。
2.三齢幼虫の収集
- 免疫染色のために、約20後期3齢幼虫（壁に徘徊し、食品から同等のボディサイズのもの）を収集。優しくバイアルまたはボトルから幼虫を選択し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で満たされた胚のガラス皿にそれらを転送するために鉗子を使用してください。
- 侵襲性のRNAの単離および定量のために、少なくとも80後期3齢幼虫（壁に徘徊し、食品から同等のボディサイズのもの）を収集。表面が覆われるまで幼虫を含むフライボトルにPBSを噴出する噴出ボトルを使用してください。
- スパチュラで食品のトップ層を柔らかくし、ペトリ皿に幼虫を含有する食品のマッシュを注ぎます。鉗子を使用して、そっと幼虫を選択し、PBSで満たされた胚のガラス皿に移します。
- PBS UNTでの洗浄の幼虫IL全ての残留食べ物が削除されます。幼虫の体（ 図2A、2Bおよび考察の章を参照）全体にランダムGFP陽性スポットを運ぶすべての"ヒョウの幼虫」を破棄する8 16Xの倍率で蛍光実体顕微鏡下で幼虫を点検。
注：RNAの単離のためには、1分間、70％EtOH中の最後から二番目の洗浄工程を含みます。 - 解剖するまで氷上でPBSで選択した幼虫を含む皿を置きます。寒さと飢餓の悪影響を回避するために30分以内に処理幼虫。
幼虫の3解剖
- 実体顕微鏡下EADを分析するために、穏やかにガラス皿の底に対する幼虫の中央部を押すように鉗子のペアを1つ使用します。第二の鉗子で、幼虫の口のフックをつかむと体（ 図2C）からそれらを引き離します。
注：引張力は、多くの場合、EADパイを接続する光ファイバ茎を破壊するのに十分です脳ローブにrを。脳またはその部品がEADに取り付けたまま、それらの存在は、さらに用途のために所望されていない場合は、鉗子の2ペアの助けを借りて光学茎を切りました。浸潤性腫瘍の場合（ 例えば 、RAS V12のScrib 1）EADと脳ローブとの間の接続は、ますますクローン細胞を過剰成長と移行することにより、時間の経過とともに不明瞭になります。- 無傷の腹側神経索（VNC）（ 図2D）とのEAD /脳の複合体を調製するために、体の真ん中に幼虫をカットするために鉗子を使用しています。後半を捨てます。
- 1鉗子の先端間の幼虫の体の前半分を持ち、第二の鉗子の先端で口のフックに押して、最初の鉗子のペアでそれ以上のキューティクルを圧延することにより幼虫内部をアウトフリップ。
- 慎重にEADのペアを残しながら、すべての余分な組織（ 例えば、唾液腺、脂肪体、および腸）を削除するか、鉗子を使用して口のフックに接続されたEAD /脳の複雑な。上層のクチクラから口のフックを解きほぐします。体の筋肉と表皮（ 図1B、2C、2D）に伸びる軸索投射を切断することによって、VNCを解放します。
注：口のフックは鉗子で組織の安全な操作を可能と洗浄中に組織のより効率的な沈没と容易に認識を容易にします。 PBSで、未定着保持したときに、比較的高速なEADの変化形態を解剖。 20〜30分に解剖時間を制限します。 - 組織を転送するには、残りの体をピペッティングすることによりコートP20マイクロピペットの先端が上下に数回の死体。大きいEAD /脳の複合体を転送するには、はさみでP20マイクロピペットの先端を切りました。
注：コーティング手順は、転送中に解剖組織の付着と損失を防止することが重要です。 P20マイクロピペットの使用が不要な限界希釈を、固定溶液にPBSの移動を最小限に抑えることができます。- 免疫染色のために、転送400μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA）固定液で満たされた0.5mLのチューブにEADを解剖。大きいEAD /脳の複合体のために1ミリリットルPFAで1.5ミリリットルチューブを使用しては、侵襲性のスコアリングのためのもの。
注意：PFAは非常に有毒です。保護手袋や衣服を着用してください。皮膚、目や粘膜との接触を避けます。 - RNA単離のために冷PBSで満たされた新しいガラス皿に解剖EADを転送します。サンプル汚染を最小限に抑えるために、リングおよびリンパ腺からEADをきれいにするために鉗子を使用してください。
- 鉗子（ 図2E）を用いたアンテナディスクと口のフックとの間の接続を切断することによって、口のフックからEADを外します。 RNA分解および遺伝子発現のアーチファクトを回避するために、30分の解剖時間を制限します。 7に進みます。
注：経験のある研究者は、幼虫の収集および洗浄に必要な時間を除いた30分で約60幼虫を解剖することができます。全RNAの収量は、遺伝子型とdevelopmenta間で異なるEADのサイズに依存しますリットルのステージ。後期3齢幼虫80から100の制御EADのペアの解剖は5-8μgの全RNAが得られるはずです。
- 免疫染色のために、転送400μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA）固定液で満たされた0.5mLのチューブにEADを解剖。大きいEAD /脳の複合体のために1ミリリットルPFAで1.5ミリリットルチューブを使用しては、侵襲性のスコアリングのためのもの。
4.固定、免疫染色、および取り付け
- 室温で章動ながら25分間PFA固定液中のサンプルを修正しました。固定時間は、組織形態およびタンパク質の抗原性を変化させることなく、60分まで延長することができます。
- 固定液を取り出して、旋回装置を用いて10分間3回PBST（0.1％トリトンX-100を含むPBS）でサンプルを洗います。各洗浄工程（400μL/ 0.5 mlチューブ）のためにPBSTの十分な量を使用してください。
注：固定EAD /脳の複合体は、免疫染色を必要としない侵襲性のスコアリングのためのもの。 GFPシグナルは固定後も表示されたまま。最終的な解剖のために4.4に進みます。- 免疫染色のため、室温で穏やかに攪拌しながら20分間ブロッキング溶液（0.3％BSAを含むPBST）200μl中、ブロック組織。
- プリムでインキュベート穏やかに振盪しながら進抗体は、4℃で一晩ブロッキング溶液100μlで希釈しました。推奨抗体希釈用の一次抗体のデータシートまたは公開された文献を参照してください。
注：一次抗体の希釈を最適化することが必要になる場合があります。 - 穏やかに暗所で4℃で一晩、室温で2時間振とうまたはながらPBSTで5〜10分間洗浄した後、蛍光二次抗体で染色組織は、ブロッキング溶液中で希釈しました。
- PBSTで洗浄サンプル3回10分。
- プリムでインキュベート穏やかに振盪しながら進抗体は、4℃で一晩ブロッキング溶液100μlで希釈しました。推奨抗体希釈用の一次抗体のデータシートまたは公開された文献を参照してください。
- 免疫染色のため、室温で穏やかに攪拌しながら20分間ブロッキング溶液（0.3％BSAを含むPBST）200μl中、ブロック組織。
- DAPI染色溶液500μlでPBSTを交換してください。 F-アクチンを標識するために、DAPI染色液に蛍光色素に結合させファロイジンを追加します。暗所で15分間の章動後、PBSTで10分間、一度組織を洗います。
注：F-アクチン標識は、DAPI染色とは独立に行うことができます。 - 最終的な解剖手順については、1ミリリットルのパイを使用して、PBSで満たされたガラス皿に戻って組織を移しますpette。口のフックをオフにクリップ鉗子の2ペアを使用します。
- 分析を妨げる可能性があります生い茂っEADとして眼茎を切断することにより、EADから侵襲性の定量化のために使用される脳を分離します。
- 客観スライド上のマウンティング培地のドロップ（22ミリメートル×22ミリメートルカバースリップのための15μl）を配置します。鉗子先端の助けを借りて、薄い層にメディアを配布します。 P20マイクロピペットとマウンティング培地にEAD、脳またはEAD /脳の複合体を転送します。
- 組織を配布し、スライド上でVNCをまっすぐにするために鉗子のヒントやタングステン棒を使用してください。
- マウント中に気泡が、最初のタッチ1マウンティング培地へのカバーガラスのエッジと鉗子の助けを借りて、マウンティング培地上にゆっくりと下の形成を避けるために。ろ紙または組織の小片を使用してカバーガラスのエッジの周りに余分なマウンティング培地を吸収するために拭いてください。
注：DABCO /ポリ（ビニルアルコール）4-88マウンティング培地硬化します時間内に4℃で。スライドを4℃でヶ月間保存することができます。
5.共焦点イメージング
- 20X、40Xと60X油の目標を装備した共焦点顕微鏡を使用して、単一の共焦点セクションとのスタックを取得します。
- ピクセルの飽和を防止します。 Zシリーズの画像解像度、レーザー入力電力、ゲイン、オフセット、フレーム平均、ステップサイズを含む同じ画像取得パラメータを使用して、異なる遺伝子型21,22間のピクセル強度の比較を可能にするために、すべての遺伝子型のため、これらの設定を維持します。
注：EAD /脳の複合体の可視化のために、最大突起部を生成し、それぞれ、隣接する画像をステッチ。最終画像の準備のため、パネルアセンブリのためのポスト画像処理ソフトウェアを使用し、明るさとコントラストを調整します。
腫瘍侵襲性の6.定量
- 腫瘍invasivenesの異なるレベルを特徴づけるます採点システムを定義します。侵略の空間パターンと脳とVNCに拡散GFP陽性細胞の量を考えるとね。ドキュメント（ 図3A）のために評価シートを準備します。
- マウントは、少なくとも80 24ミリメートル×50mmのカバースリップあたりマウンティング培地40μlのを使用して1つのスライド上の各遺伝子型について、無傷の脳を固定します。
- 公平な採点を可能にするために、スコアリング手順が公平になるように、スライドを匿名中性パーティをお願いします。独立して2ラボメンバーによる匿名化スライドを評価します。カウントが終了した後にのみ遺伝子型を開示しています。
- GFPフィルターセットを装備した蛍光実体顕微鏡下に取り付けられた脳のブラインドスコアリングによって悪性度を評価します。既にダブルカウント（ 図3B）を回避するために視聴されている脳を標識するためのマーカーを使用してください。
- 遺伝子型ごとに定義された侵襲性の各カテゴリに陥る脳の割合を計算します。統計のを決定しますカイ二乗検定（ 図3C）を使用してignificance。
7. RNAの単離、DNアーゼ処理、および品質チェック
注：以下の手順で使用される全ての試薬（ソリューション、プラスチック製品）はRNase活性があってはなりません。必ず手袋を着用し、有機溶媒での作業のための化学フードを使用します。
- 1.5ミリリットルチューブにコーティングされたP20のマイクロピペットチップできれいEADを転送します。
- 慎重にPBSを除去し、（最大140 EADのための十分な）100μlのRNA溶解試薬と交換し、チューブの底に組織シンクをしてみましょう。
- ボルテックスにより溶解組織。この時点で、試料を液体窒素中で凍結し、-80℃で保存された深い直接標準RNA単離プロトコールを用いて処理することができます。
注：複数の解剖ラウンドからの同様の遺伝子型のサンプルは、RNA溶解試薬で一度にプールすることができます。 - RNA溶解試薬で0.9ミリリットルのサンプル容量を入力します。クロロホルムとミックスサンプルヴィゴロの0.2ミリリットルを追加します。15-20秒間usly。
- 室温で2〜3分間インキュベーションした後、4℃で15分間10,000×gで試料を遠心します。
- 相間を乱すことなく、新しいチューブにRNAを含む無色の上部の水相を転送します。それは、タンパク質およびゲノムDNAを含むように相間から近づきません。
注：回収されたボリュームは、均質化のために使用されるRNA溶解試薬の体積の約60％であるべきです。 - イソプロピルアルコールを0.5mlを添加することにより、RNAを沈殿させます。ボルテックスし、室温で10分間サンプルをインキュベートします。
- 4℃で15分間万×gでサンプルを遠心。
- 上清を捨て、75％エタノール600μlので一度RNAペレットを洗浄。短いボルテックスし、遠心分離（4℃、7分間万XG）後、すべてのエタノールを破棄し、RNAペレットを空気乾燥きれいなティッシュワイプに開いたチューブを配置する5〜10分間にしましょう。
注：RNAペレットは、小さな不透明/ホワイトSTなどの目に見えるかもしれませんチューブまたは非表示の下部に熟しました。残りのエタノール滴を注意深くP10マイクロピペットチップを用いて除去することができます。 - ピペットチップを通して数回ボルテックスまたは溶液を通過させることによってDEPC処理水50μl中のRNAを溶解させます。
- ゲノムDNAの混入を最小限に抑えるために、DNアーゼの1μlの（2 U /μl）をし、DEPC処理水で10倍DNアーゼ緩衝液10μlを含むミックス50μlのを追加することにより、DNアーゼとのトータルRNAを扱います。ボルテックスとスピンダウン。
- 水浴または30〜40分間加熱ブロック中、37℃でサンプルをインキュベートします。インキュベーション後、各サンプルにDEPC処理水100μlを追加します。
- 4℃で7分間ソリューション、1分間ボルテックスし、遠心万×gでサンプル：クロロホルム：イソアミルアルコール（1：25：24）DNアーゼから酵素活性を、きれいなRNAを不活性化するために、フェノール200μlのを追加します。
- 慎重に新しいチューブにRNAを含む上部の水相を転送します。等容積（200μl）を追加します。クロロホルム、ミックスして上から遠心分離工程を繰り返します。
- 慎重に上相を収集し、3 M酢酸ナトリウム1/10容量を追加することにより、RNAを沈殿させ、pHを5.2には、100％エタノールのDEPC H 2 Oおよび2.5容量で製造しました。ボルテックスで混ぜます。
注：沈殿ミックスに0.5μlのグリコーゲン（20μgの/μl）を追加すると、RNAペレットを可視化するのに役立ちます。 RNAの損失を最小限にするために、シリコーン処理、低結合1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを使用しています。 - 少なくとも1時間、-20℃でRNAを沈殿させます。
注：インキュベーションを一晩行っている可能性があります。サンプルは、同様に-80℃に置くことができます。 - 4℃で30分間万×gでの遠心分離によってペレットRNA。 7.9での説明の後洗浄し、乾燥したペレット。
- DEPC処理水の10〜15μlのRNAを溶解させます。 -80℃で保存するRNA。
- 分光光度計を用いて230 nmで、260 nmおよび280 nmでODを測定することにより、RNAの量と純度を決定します。 RNAの共同を計算します規則を適用することによりncentration 40 / mlのRNAに等しいnmの260での1 ODいます。
注：A 260/230比は2.0から2.2の範囲内であるべきである一方で、「純粋な」RNAのA 260/280比は2.0に等しいです。 1.7と2.0の間のA 260/280比を有するRNA試料は、cDNA合成などの下流の用途に適しています。 mRNA-seqのライブラリーの調製のためのRNAの質と量は、自動電気泳動システムを使用してチェックする必要があります。 28S / 18S比は1.8以上である必要があります。
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Representative Results
クローンの3種類が誘導されたショウジョウバエ EADで定義された遺伝子型のGFP-マークされたパッチを生成するために、eyFLP-MARCM技術の可能性を実証するために：（1）コントロールのみGFPを発現する、（2）悪性腫瘍が小さいの発癌性型を発現します腫瘍抑制遺伝子の落書きのホモ接合損失（ のScrib 1）の背景には、Gタンパク質のRas（ラスV12）、及び（3）過剰成長が、非侵襲性のras V12のScrib 1 JNK DNクローンを、6月-N末端キナーゼ（JNK）は、そのドミナントネガティブフォーム（ 図4、遺伝子型について表1）の発現により不活性化しました。 RAS V12ののScrib 1クローン性腫瘍の侵襲性がJNKシグナル伝達の異常な活性化を必要とし、その下流の転写は10,12,23,24因子ことが示されています。また、 ラスV12ののScrib 1 14,25への免疫細胞（と呼ばれる血球）の浸潤が生じ、 ショウジョウバエの幼虫に強い炎症反応を促進します。
レベルとモザイク組織内および個別の遺伝子型の腫瘍のうち、JNK活性の空間分布を監視するには、確立されたトランスジェニック、JNK応答性TRE-のDsRedレポーターが26を採用しました。解剖し、固定EADおよびEADの共焦点顕微鏡は、/脳の複合体は、悪性のras V12ののScrib 1腫瘍（ 図4B）を有する組織中のTRE-DsRedをレポーター活性の著しいアップレギュレーションを明らかにしました。 DsRedの信号、標識のras V12ののScrib脳葉の上に広げ、VNC（ 図4E、4F）を侵入EAD（ 図4B）ならびに腫瘍細胞における1個のクローン。これとは対照的に、TRE-のDsRedレポーターactivityがコントロールディスク（ 図4A '）の眼部への触角から伸びる細胞の文字列に制限されたままでした。 JNKシグナル伝達をブロックすると、クローンのras V12ののScrib 1 JNK DN腫瘍 （ 図4C、4D）でTRE-DsRedの信号の劇的な減少をもたらしました。これらのデータは、このように、悪性のras V12ののScrib 1腫瘍におけるTRE依存性転写応答を活性化するためのシグナリングJNKの要件のための機能的な証拠を提供します。 ショウジョウバエを追跡するために考案系統特異的hmlΔ-DsRedをレポーターが、27,28は悪性のras V12ののScrib 1腫瘍（ 図5B）を有する組織における免疫細胞の蓄積を示した血球。これとは対照的に、唯一の個々の血球または少数のローカライズされた血球のパッチは、コントロールとのras V12のScrib 1 JNK DNモザイクEADおよび脳組織で検出されました（ 図5A、5C）。汎血球抗Hemese抗体（H2）を用いた免疫染色29は hmlΔ-のDsRed陽性細胞（ 図5D、5E）の免疫細胞の同一性を確認しました。公表された報告12,23,24と一致して、腫瘍侵襲性の公正な定量化は、隣接する脳のローブとVNC（ 図3C）に腫瘍の浸潤を促進する上でJNKシグナル伝達の中心的な役割を裏付け。最後に、全RNAをモザイクEADから単離しました。サンプルは、定量RT-PCRのいずれかに供さや質と量のために自動化された電気泳動装置で分析した。 図6（a）は、以前に確認し、悪性のras V12ののScrib 1クローン性腫瘍を保有するEADにおけるマトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP1）転写物の有意なJNK依存アップレギュレーションを示しています公開された調査結果12,24,30,31。自動電気泳動システムを用いて全RNAの評価はTを示し帽子三つの独立EADサンプルが1.8（ 図6B）上記28S / 18S比を有しました。しかし、EAD 2 RNAは、ゲル（ 図6C）上にスミアによって反射された、部分的に分解しました。対照的に、EAD 3サンプルが低濃度でした。ゲル画像（ 図6B）に、より高い分子量および電気泳動（ 図6C）上の小さなピークの複数のバンドは、また、DNAの混入を示唆しました。したがって、唯一のEAD 1のサンプルは、mRNA-seqのライブラリーの調製に適しているであろう。
図1： ショウジョウバエ EADと下流のアプリケーション における遺伝的モザイクを生成するためのMARCMシステムの回路図 （A）MARCMシステムは、そうでなければ、野生型で定義された遺伝的病変を有するクローンパッチを生成することができる（ヘテロ接合）。コンテキスト。組織特異的プロモーター（ 例えば、 アイレス ）の制御下でFLPの発現は、STOPカセットに隣接する2つのFRT要素間の組換えを触媒するイエロー（Y）遺伝子（ 行為>のy +>のGal4）が付いています。 STOPカセットを除去すると、普遍的にこのようなUAS-GFP（またUAS-のras V12）などの任意のUASベースの導入遺伝子の発現を駆動することができるGAL4転写活性化因子（ 行為-GAL4）を表明しました。親細胞では、しかし、GAL4活性は、その発現がチューブリンプロモーター（ 浴槽-GAL80）によって制御されるGAL80プレッサーによって遮断されます。細胞周期のG2期では、FLPは、FRT部位に遠位の相同染色体の間の非姉妹染色分体交換を仲介します。有糸分裂中に組換え染色体の分離は1つが、特定のゲノム遺伝子座（ 例えば 、 のScribのためのホモ接合変異体であること、2つの娘細胞に上昇を与えます
図2：eyFLP-MARCM 82Bグリーンテスターを用いて誘導制御GFP標識クローンを保有する第三齢幼虫の3齢幼虫とEADとEADの代表例/異なる下流の用途に使用される脳の複合体の選別 （AB）蛍光顕微鏡写真。 EADと脳葉に限定クローンで（A）代表制御幼虫。 （B）体全体に様々な組織におけるGFP陽性クローンを運ぶ「ヒョウの幼虫」の一例。 （C）解剖EADの明視野画像と口のフックに接続されている（D）EAD /脳の複合体、及び（E）EADは、口のフックを含むすべての余分な組織から掃除しました。スケールバー= 2ミリメートル（AB）から500μm（CE）。fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3： 腫瘍侵襲性の定量 RAS V12のScrib 1幼虫（7日AEL）から解剖脳の（A）蛍光共焦点画像は、非侵襲性に至るまで腫瘍侵襲性の四つの異なるグレードの実例を表す（スコア0）、侵略1脳ローブ（スコア1）、クローン組織は、両方の脳ローブをカバーし、VNCを入力すると強力な腫瘍浸潤に侵入し、両方の脳ローブ（スコア2）（3スコア）。画像はスコア2と3のための複数の共焦点セクションと例の突起が2×2の共焦点画像から縫合されています。スケールバー=100μmである。（B）公平のために使用される固定脳を持つ匿名顕微鏡スライドの例蛍光実体顕微鏡下で得点。得点脳は、重複登録を防ぐために、ペンでマークされています。 1腫瘍侵襲性の高いのras V12ののScribと比較するとスケールバー= 500μmの（C）、JNKの阻害（RAS V12のScrib 1 JNK DNを ）シグナリングは、クローン細胞の侵入を排除した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 悪性 ラス 「V12」 のScrib「1 クローン性腫瘍 における 転写 TRE-のDsRed レポーター の活性化は、JNK 依存性です（。 TRE-DsRedをレポーターが（矢頭）眼部への触角から実行している細胞の狭いストライプを標識しました。 （B）TRE-のDsRedレポーターの活性が顕著に周囲の非クローンEAD上皮と比較したras V12ののScrib 1 GFP陽性クローンで拡張されました。 （C）JNK活性の阻害は、RAS V12用のScrib 1 JNK DNクローンでのDsRedシグナル強度の明らかな減少をもたらしました。 （D）のDsRedシグナルのさらなる増強は、RAS V12のScrib 1 JNK DNクローンを周囲の細胞でJNKシグナルの非自律活性化を明らかにしました。 （E）は 8日目AELには、RAS V12ののScrib 1細胞は、全体のEADとVNC（矢印）に脳ローブに広がるをovergrew。 （F）領域メートルのVNC（クローズアップを侵略クローン細胞Eの矢印でarked）のDsRed信号のために濃縮しました。複数の共焦点切片の（AC）を表示する突起部、（E）は、3×3共焦点画像から縫合されていると（D、F）は、単一のセクションを表します。スケールバー=50μmです。 EAD、眼/触角。 BL、脳の葉; VNCは、腹側神経索。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： リネージュ固有の HMLΔは 、トランスジェニックレポーターは ラス V12 のScrib 1 腫瘍関連血球 の濃縮を明らかにする -DsRed制御EAD（A）において、hmlΔ-のDsRedレポーター標識血球CLU。 stersは、目や触角上皮のくぼみにトラップされます。 （B） のras V12ののScribからなるEADおよび脳組織は、1 GFPでマークされた腫瘍は、すべてのクローン組織に散らばっ血球数の増加を示しました。 （C）は、関連した血球の数は劇的のRAS V12用のScrib 1 JNK DNモザイク組織におけるJNKシグナル伝達の阻害の際に減少しました。 （DE）HmlΔ-のDsRed陽性の血球はまた、汎血球マーカーHemeseを検出H2-抗体で標識しました。複数の共焦点切片の（AC）を表示突起が、（A）は、X 2 2と（BC）から縫合され、3×3の共焦点画像から縫合されています。 （DE）は、単一のセクションを表します。スケールバー= 100μmの（AC）と10ミクロン（DE）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6： 解剖EADから単離された全RNAの量と質の評価 （A）各遺伝子型のために4生物学的複製を使用して定量RT-PCRの結果の代表例MMP1の転写レベルがrp49に正規化しました。遺伝子発現の倍変化は、相対標準曲線法32を用いて計算しました。データは平均値±SEMです。 ***不等分散を持つスチューデントの不対両側t検定を使用してP <0.001。自動電気泳動システムを用いて、全RNAの質および量の（B、C）の評価。仮想ゲルイメージ（B）は、電気泳動図に明確に定義されたピーク（C）に対応し、18Sおよび28SのrRNAの2顕著なバンドを示しています。 DNAの混入とRNAの分解は、などによって反射され、mear（矢頭）とextranumeraryバンドとピーク（矢印）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| フライ株 | ソース/コメント |
| eyFLP1;行為> Y +>のGal4、UAS-GFP; FRT82B、浴槽-GAL80 | eyFLP-MARCM 82Bグリーンテスター11 |
| ワット; UAS-のras V12; FRT82BのScrib 1 / TM6B | 12 |
| ワット; UAS-のras V12; UAS-JNK DN FRT82BのScrib 1 / TM6B | 12 |
| ワット; hmlΔ-のDsRed; FRT82B | 本研究では、 ワット。カーチャブリュックナー28からhmlΔ-のDsRed |
| ワット; UAS-RAS V12hmlΔ-のDsRed; FRT82BのScrib 1 / TM6B | この研究 |
| ワット; UAS-RAS V12hmlΔ-のDsRed; UAS-JNK DN FRT82BのScrib 1 / TM6B | この研究 |
| ワット; TRE-のDsRed; FRT82B | 本研究では、 ワット。ディルクBohmann 26からTRE-のDsRed |
| ワット; UAS-RAS V12 TRE-のDsRed; FRT82BのScrib 1 / TM6B | この研究 |
| ワット; UAS-RAS V12 TRE-のDsRed; UAS-JNK DN FRT82BのScrib 1 / TM6B | この研究 |
表1： 本研究で使用した ショウジョウバエ株 の概要 。
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Discussion
ショウジョウバエにおける遺伝的モザイクを生成するための技術は、遺伝子機能33を解析し、操作するための最も洗練されたツールの一つです。それはアイレスエンハンサーは9,18アクティブになっている組織では、空間的に制限された方法で視覚的にマークされ、遺伝学的に定義されたクローン、 すなわちの誘導を可能にするようeyFLP-MARCMシステムは、強力で堅牢であることが証明されました。複数の遺伝的病変は、同じ細胞内で合成される場合に特に重要です。 EADと脳neuroepitheliaに限定するとき、これらの高度に異常なパッチは幼虫の開発を可能にしながら、熱ショック制御FLP（hsFLP）クローンの場合のように幼虫の体に散在するとき、彼らは致死性を引き起こす可能性があります。重要なことは、活性化された癌遺伝子は腫瘍抑制の損失と結合するフライEAD上皮におけるクローンの誘導は、いくつかのヒト癌における固形上皮腫瘍の発生と進行を再現します。ホーweverは、システムはまた、簡単に説明するには限界を有しています。昆虫が開いた循環系を持っていることを考えると、ヒトの癌で観察されるように真の転移は発生しません。したがって、転移性播種の複雑なプロセスを忠実ショウジョウバエでモデル化することはできません。それにもかかわらず、このようなras V12ののScrib 1クローンとしてEADの腫瘍は、彼らがEADを取り巻く基底膜を破壊し、隣接する脳11,12,31に侵入として悪性のプロパティを表示しません。本研究に記載されているように、腫瘍の攻撃性の程度が異なる遺伝子型間で定量化し、比較することができます。モザイクEAD中の特定の遺伝的病変の存在は、幼虫の成長の発生のタイミングと期間に影響を与える可能性があることに注意することも重要です。幼虫のステージングはモザイク組織の分析は、同じ年代や発達段階の動物を用いて行われるかどうかを判断します。パイロット実験を実施することの影響を評価します発生のタイミングに新しいEADクローン遺伝子型が望ましいです。
技術的な制約にもあります。まず、eyFLP-MARCMツールで構築することができ、異なるクローンの遺伝子型の数は素晴らしいが、無限ではありません。例えば、異なる染色体上に存在する組み合わせた2突然変異対立遺伝子を同時に両方の染色体上での組換えの効率が低いことによって妨げ、そして小さな四染色体上に位置する遺伝子は、一般的にアクセスできませんされています。トランスジェニックRNAiを用いて遺伝子ノックダウンは、代替ソリューションです。 GAL80リプレッサーが分解されないまで - しかし、導入遺伝子が直ちに有糸分裂組換えの際に発現されないことを認識することが重要です。 GAL4 / UAS発現系の活性は、29℃で成長幼虫によって高めることができます。高温が成長率、発生のタイミング、metaboli含む様々な、発達生理学的および分子パラメータに影響を与えることを心に留めておくために、しかし、重要ですSMおよび遺伝子発現を34-37。したがって、このような幼虫のステージングやトランスクリプトームプロファイリングのための解剖EADの数として提供するプロトコルへの適応が必要であろう。
eyFLP-MARCMテスターは、健康的な株の中ではありません。 1ゲノムの妥協で複数の導入遺伝子は、フィットネスと繁殖力が飛びます。これらの株式は維持され、処女雌の大規模なコレクションのために拡張されるように特別な注意が必要です。本研究では、MARCM 82Bグリーンテスターライン11に記載されているように、実行可能なときにホモ接合もののは、遺伝的に不安定です。これは、腸、気管、脂肪体、および幼虫の表皮を含む様々な倍数体組織内異所性、GFP標識クローンを表示する「ヒョウの幼虫」の自発的な外観から明らかです。この現象は、父方の遺伝子型に関係なく、すべての交配で発生します。私たちは、異所性GFPパッチは、2つのFR間で制御されていない、確率的組換えから生じると推定します黄色+マーカーと"STOPカセット」の除去を引き起こすFLPアウトカセットでのTサイト、。倍数体の組織では、 チューブリンプロモーター駆動GAL80リプレッサーは、GAL4活性を阻止するには不十分かもしれません。 EADと脳以外の組織における遺伝的に改変された細胞の存在が実験的クローンの挙動に影響を与える可能性のある全身の信号を引き出すことができます。これらの「ヒョウの幼虫は、「したがって、分析から除外されるべきです。単一のオス - メスの交配からまた、私たちが日常的に再確立MARCM 82Bグリーンテスター。
上記の落とし穴にもかかわらず、遺伝子機能を研究するためのeyFLP-MARCMシステムのアプリケーションおよびクローンの腫瘍とその環境との相互作用は多様です。そのようなのLexA / LexOp 38または薬物の制御QF / QUAS / QS 39,40としてのGal4 / UAS-独立したバイナリ発現システムの導入は、導入遺伝子のexpを細かく制御を提供するであろうressionおよび/または同時標識およびクローン、非クローン性上皮細胞および血球などの異なる細胞集団の操作。このようなモザイク組織が再びここに記載されているプロトコルに従って処理することができます。
3齢幼虫（プロトコル部3）からモザイクEADの解剖のための方法およびEAD /脳の複合体は、同様に、以前の発達段階にも適用することができます。重要なことは、EAD /脳の複合体のためのプロトコルは、翼、平均棍と脚成虫の回復を可能にします。これらは、RNA単離のために使用されるべきである（プロトコルのセクション3.3.2および7）、関心のディスクは無関係な組織から洗浄し、EADと同様に処理されるべきです。それらの小さいサイズを考慮すると、収集平均棍と脚ディスクの数は、RNAの十分な量を得るために増加されるべきです。
EAD（プロトコル部7）からの全RNAの抽出のためのプロトコルは、異なる商業Vから入手できるRNA溶解試薬に基づいていますendors（マテリアル/機器のリストを参照してください）。手順の全体的な成功は、主に依存する：（ⅰ）幼虫の十分な数を有する、（ii）の解剖、および（iii）のRNaseから無料サンプルを維持しながら、迅速かつ正確であること。 RNaseフリーのプラスチックウェアとソリューションを使用して、手袋を着用し、清潔な作業スペースや楽器を維持し、氷上でサンプルを維持することは、すべてのRNAの分解を減少させます。完全にDNase処理（プロトコルセクション7.11）によって除去されない可能性があります任意のゲノムDNAとRNAの混入を防ぐためには、最初の時間（プロトコルのセクション7.6）のための水相を収集する際相間を回避することが重要です。 DNA汚染およびRNA分解の両方は、自動電気泳動システム（ 図6B、6C）でサンプルを実行することによって明らかにすることができます。 RNA単離プロトコールは、より広範な用途を有します。これは、正常成人から、異なる発生段階で全体の幼虫からのRNA抽出のために使用され、さまざまなされています幼虫の臓器。得られたRNAは、定量RT-PCRおよびmRNA-seqの20,24,41,42によるゲノムワイドなトランスクリプトーム解析の両方に適していました。最大で選択したmRNAの数十を定量する定量RT-PCRと比較して、公平なmRNAの配列決定は、ゲノムワイドな発現解析を可能にします。このように、1は、腫瘍形成24の異なる段階で、特定の遺伝子損傷によって誘発された腫瘍の全体のトランスクリプトームの署名を比較することができます。結果だけでなく、クローンでなく、周囲の、非クローン性組織の変化を反映するように、RNAは、全体のディスクから来ることを心に留めておくことが重要です。細胞-利用可能なプロトコルを適応させることによって解離したモザイクEAD上の蛍光活性化セルソーティング（FACS）を実行43,44は、特定の細胞集団、 例えば 、クローン（GFP +）と非クローン（GFP）の転写署名を決定するために適用することができます。
ここで説明する固定および免疫染色プロトコルは、サイマルに適しています特異的抗体およびトランスジェニックレポーターの活性を有する目的のタンパク質のtaneous可視化。本研究で使用される2つのトランスジェニックレポーターのいずれかによって産生さクローン細胞とのDsRed蛍光マーキングGFP信号の両方は、固定および免疫染色を通じて保存され、直接、共焦点顕微鏡によって可視化することができます。しかし、蛍光タンパク質に対する抗体は、信号強度を増幅することができます。同様に、抗βガラクトシダーゼ抗体の使用は、細菌のlacZ遺伝子に基づいて、トランスジェニックレポーターの検出を容易にします。相対的レポーター活性は、非クローン性組織を用いた画像解析ソフトウェア（ 例えば、フィジー、ImageJの）対クローンの相対的なピクセル強度を測定することによって評価することができます。異なるクローンの遺伝子型間レポーター活性を比較すると、画像取得設定は、（プロトコル部5と参考文献21,22）一定に保たれなければなりません。プロトコルは、多くの異なるAとうまく動作しますがntibodies、推奨抗体濃度を最適化する必要があるかもしれません。変化はまた、固定時間、種類と濃度の洗剤（トリトンX-100、Tween-20を、サポニン）および固定液（8％PFA、4％ホルムアルデヒド、エタノール）で必要になる場合があります。
上述のプロトコルとは異なり、腫瘍侵襲性の定量化は、三齢幼虫期およびEAD /脳の複合体に限定されています。それにもかかわらず、その全体的な根拠は、認知バイアスを回避する必要がある任意の定量的研究に適用することができます。この方法は、徹底が必要です。時間内に腫瘍の悪性度が増加するにつれて、それは同じ年齢の幼虫を比較することが不可欠である（ 例えば、産卵後の7または8日）。時間とともにクローン腫瘍が大量に過剰成長することができ、まだ腫瘍細胞は、EADの中に残ることがあります。脳はEAD（議定書のセクション4.4.1）から分離する工程は、偽陽性侵襲カウントを回避することが重要です。添付のEADと脳の取り付けはflattます組織エン、脳構造を覆い、したがって任意の定量化を防止するための過成長EADを引き起こします。理想的には、1は、生きている幼虫に直接侵襲的なプロセスをキャプチャしたいと思います。関与する細胞集団や組織を可視化するトランスジェニック記者が入手可能であり、eyFLP-MARCMシステムと組み合わせることができます。残念ながら、侵襲的なプロセスは、日にはまだしばらく生きている幼虫を維持するとの互換性がない時間枠を数時間かかります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany | 00262-0500 | Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85 °C. |
| Corn syrup | Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany | 01939 | |
| Propionic acid | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6026.1 | |
| Cornmeal | ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany | 4010155063948 | |
| Malt extract | CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany | 728985 | |
| Soy flour | Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany | 1000246441010 | |
| Yeast | Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany | 210099K | |
| Methyl-4-benzoate/ Nipagin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | H5501 | Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH |
| Drosophila fly food vials | Kisker Biotech, Steinfurt, Germany | 789008 | |
| Vial plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 | |
| Drosophila fly food bottles | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 960177 | |
| Bottle plugs | K-TK e.K., Retzstadt, Germany | 1002 S | |
| Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 81381 | Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50 °C and centrifuge 20 min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D2522 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 9002-93-1 | |
| Phosphate-buffered saline/ PBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 in Millipore H2O | ||
| PBST | 0.1% Triton X-100 in PBS | ||
| Paraformaldehyde/ PFA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | 158127 | 4% PFA fixative recipe: Dissolve 4 g PFA in 80 ml Millipore H2O on a magnetic stirrer plate heated to 55 °C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 µl Triton X-100 and fill up with Millipore H2O to 100 ml. Store aliquots at -20 °C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.) |
| Bovine Serum Albumin/ BSA | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A3059 | Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST |
| Fluorescently labeled phalloidin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes | A12379, A22283, A22284 | Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 °C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST. |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335 | DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H2O and store aliquots at 4 °C. Used in dilution 1:1,000 in PBST. |
| Mouse anti-H2 antibody | Kurucz et al., 2003 | Used in dilution 1:500 in blocking solution | |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK | 715-175-151 | Used in dilution 1:500 in blocking solution |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11295-10 | |
| Glass embryo dish (30 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | E90 | |
| Tungsten needles | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 10130-20 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 26018-17 | |
| Microscope slides | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1553 | |
| Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser) | VWR, Darmstadt, Germany | 631-1336 | |
| Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 1076371 | |
| Kimtech Science Precision Wipes | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 06-677-70 | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan) | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus, Hamburg, Germany | SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera | Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11. |
| Confocal microscope | Olympus, Hamburg, Germany | FV1000 | Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) and 60× UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50 mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40 mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15 mW) and Red Laser diode 635 (20 mW). Software: Fluoview 2.1c Software |
| Drosophila cooled incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Sanyo MIR553 | |
| Squirt bottle | VWR, Darmstadt, Germany | 215-8105 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | VWR, Darmstadt, Germany | 15172-203 | |
| ELMI Digital Rocking Shaker | VWR, Darmstadt, Germany | DRS-12 | |
| 5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent | VWR, Darmstadt, Germany | 2302700 | The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, e.g., TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596). |
| Diethyl pyrocarbonate/ DEPC | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | D5758 | Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H2O, stir overnight and autoclave. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15593-031 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| TURBO DNase (2 U/µl) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | AM2238 | |
| Invitrogen UltraPure Glycogen | ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10-814-010 | |
| Sodium acetate trihydrate | VWR, Darmstadt, Germany | 27652.232 | Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H2O and adjust the pH to 5.2 |
| 2-Propanol | Merck, Darmstadt, Germany | 109634 | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 100983 | Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H2O. |
| UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000 | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | ND-8000 | |
| Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated) | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 5417R | |
| Experion RNA StdSens Analysis Kit | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007103 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 7007010 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | 18080044 | |
| Oligo d(T) Primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | Prepare 100 µM stock solutions in DEPC-H2O and store at -20 °C | |
| dNTP Mixture | Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France | 4030 | Store aliquots of 25 µl at -20°C |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 1855195 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | 170-8882 | |
| Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | HSP9601 | |
| Microseal 'B' Film | Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany | MSB1001 | |
| rp49 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3' | |
| rp49 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3' | |
| mmp1 Forward primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3' | |
| mmp1 Reverse primer | Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium | 5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3' |
References
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