Définition Substrat Spécificités pour lipase et phospholipase candidats
Summary
Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.
Abstract
Microorganismes produisent un large spectre de (phospho) lipases qui sont sécrétées dans le but de faire des substrats extérieurs disponibles pour l'organisme. Alternativement, d'autres (phospho) lipases peuvent être associées physiquement l'organisme producteur provoquant un chiffre d'affaires de lipides intrinsèques et souvent donner lieu à un remodelage des membranes cellulaires. Bien que les potentiels (phospho) lipases peuvent être prédits avec un certain nombre d'algorithmes lorsque la séquence de gène / protéine est disponible, la preuve expérimentale de l'activité des enzymes, des spécificités de substrat et les fonctions physiologiques potentiels a souvent été obtenu. Ce manuscrit décrit l'optimisation des conditions d'essai pour les futurs (phospho) lipases avec des spécificités de substrat inconnus et comment employer ces conditions optimisées dans la recherche pour le substrat naturel d'un (phospho) lipase respective. En utilisant des substrats chromogènes artificiels, tels que les dérivés p – nitrophényle, peuvent aider à détecter un mineurl'activité enzymatique d'un (phospho) lipase prédite dans des conditions standard. Après avoir rencontré une telle activité enzymatique faible, les paramètres distincts d'un dosage enzymatique peut être modifiée afin d'obtenir une hydrolyse plus efficace du substrat artificiel. Après avoir déterminé les conditions dans lesquelles une enzyme fonctionne bien, une variété de substrats naturels potentiels doit être testé pour leur dégradation, un processus qui peut être suivie en utilisant des méthodes chromatographiques distinctes. La définition des spécificités de substrat pour de nouvelles enzymes, fournit souvent des hypothèses pour un rôle physiologique potentiel de ces enzymes, qui peuvent ensuite être testés expérimentalement. Suite à ces directives, nous avons été en mesure d'identifier une phospholipase C (SMc00171) qui dégrade la phosphatidylcholine à phosphocholine et diacylglycérol, dans une étape cruciale pour le remodelage des membranes dans la bactérie Sinorhizobium meliloti sur les conditions de phosphore limitation de la croissance. Pour deux prédit patatin-comme phospholipases (SMc00930 et SMc01003) du même organisme, nous pourrions redéfinir leurs spécificités de substrat et de préciser que SMc01003 est une lipase de diacylglycérol.
Introduction
Lipides à base de glycérol tels que triacylglycérols et (glycéro) phospholipides constituent importante et probablement les classes de lipides les plus connus 1. Triacylglycérols (TAG) sont des graisses ou des huiles, qui fonctionnent habituellement comme les lipides de stockage, et donc en tant que sources d'énergie et de carbone potentiels. TAGs peuvent être dégradés par les lipases, qui sont souvent sécrétées par l'organisme producteur à digérer TAGs externes et les rendre disponibles en tant que sources de carbone. En outre, les lipases ont été largement étudiés au cours des années en raison de leurs applications biotechnologiques importantes 2.
En raison de leur nature amphiphile et leur forme quasi cylindrique, les propriétés des membranes formant (glycéro) phospholipides présentent et constituent généralement les principaux composants lipidiques d'une membrane bicouche 3. Dans les micro – organismes simples, tels que la bactérie Escherichia coli, seules les trois principales variantes de groupe de tête, le phosphatidylglycérol (PG), cardiolipine (CL), et phosphatidylethanolamine (PE) sont rencontrées, mais il faut savoir que chacun d'entre eux pouvant être substitué par un grand nombre de différentes chaînes d'acyle gras en position sn -1 et sn -2 positions donnant lieu à un grand nombre d'espèces moléculaires différentes 4 . D'autres bactéries pourraient avoir d'autres phospholipides, en plus ou au lieu. Par exemple, Sinorhizobium meliloti, une bactérie du sol, qui est capable de former une racine nodule symbiose fixatrice d'azote avec la luzerne , des légumineuses (Medicago sativa), contient en outre au PE d' un second phospholipide zwitterionique, la phosphatidylcholine (PC) 5. En outre, les lipides ne contenant pas de phosphore ou de glycérol peuvent faire partie amphiphile et la forme de la membrane cellulaire. Par exemple, des conditions de croissance du phosphore limitatif, en S. meliloti (glycéro- phospholipides) sont en grande partie remplacés par des lipides membranaires qui ne contiennent pas de phosphore, à savoir, les sulfolipides, les lipides ornithine et diacylglyceryl trimethylhomoserine (dgts) 6. Chez les bactéries, dgts est formé à partir de diacylglycérol (DAG) dans une voie à deux étapes 7 , mais la source pour la génération DAG était pas claire. Expériences pulse-chase ont suggéré que PC pourrait être un précurseur pour dgts 8 et en utilisant la méthodologie décrite dans ce manuscrit nous avons pu identifier une phospholipase C (PLCP, SMc00171) qui est formé dans des conditions de phosphore limitatif et qui peut convertir PC en DAG et phosphocholine 8.
Dans une étude séparée, nous avons découvert que l'acyl-CoA synthétase (FADD) mutant déficient de S. meliloti ou d'Escherichia coli accumulée des acides gras libres lors de l' entrée en phase stationnaire de croissance 9. Bien que ces acides gras semblent être dérivés à partir des lipides membranaires, l'origine précise pour les acides gras libres ou de l'enzyme (s) en les libérant sont pas connus. Encore une fois, en utilisant la stratégie décrite dans ce manuscrit, deux 10 (phospho) lipases patatine-like (SMc00930 et SMc01003) qui a contribué à la formation d'acides gras libres dans S. meliloti 11 ont été prédit. De manière surprenante, SMc01003 DAG utilisé comme substrat le convertissant en monoacylglycérol et , enfin , du glycérol et des acides gras libres 11. Par conséquent, SMc01003 est une lipase DAG (DGLA).
Bien qu'un certain nombre d'algorithmes existent pour prédire le potentiel (phospho) lipases 12,13, leur fonction précise et rôle physiologique est généralement pas connue. Nous présentons ici un protocole, pour cloner et surexpriment (phospho) lipases prédites ou potentiels. Ce manuscrit explique comment les dosages enzymatiques peuvent être développées et optimisées pour le (phospho) lipase surexprimé en utilisant des substrats chromogènes artificiels. Nous fournissons des exemples comment avec un test enzymatique optimisé réel (phospho) substrat de lipase peut être rencontré et comment ces résultats pourraient enrichir notre compréhension de la physiologie microbienne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours des 20 dernières années, les génomes de nombreux organismes ont été séquencés et même si un grand nombre de données de séquence du génome a été générée, l'interprétation fonctionnelle est à la traîne et entrave donc notre compréhension du fonctionnement du génome. fonctions de gènes dans les génomes sont souvent attribués en fonction de similarité avec des gènes de la fonction ou l'apparition de motifs conservés connu. Cependant, la fonction précise d'un gène donné est …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-Mexique) (82614, 153998, 253549 et 178359 dans Investigación Científica Básica ainsi que 118 à Investigación en Fronteras de la Ciencia) et de Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM DGAPA-; PAPIIT IN202616, IN203612).
Materials
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Methanol | JT Baker | 9070-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Acetic Acid | JT Baker | 9507-05 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Hexanes | JT Baker | 9309-02 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Diethylether | Sigma | 32203 | Enzymatic assays |
| bidistilled water | ANY | NA | Enzymatic assays |
| Tris Base | Sigma | T-1503 | Enzymatic assays |
| HCl | Baker | 9535-02 | Enzymatic assays |
| NaCl | Baker | 3624-01 | Enzymatic assays |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | Enzymatic assays |
| LB broth | ANY | NA | Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water |
| tryptone | Becton Dickinson and Company | 211705 | Bacterial growth |
| yeast extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | Bacterial growth |
| TY broth | ANY | NA | Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water |
| CaCl2 2 H2O | Baker | 1332-01 | Enzymatic assays |
| isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529-019 | Bacterial growth |
| Diethanolamine | Sigma | D-8885 | Enzymatic assays |
| MnCl2 | Sigma | 221279 | Enzymatic assays |
| Phospholipase A2 snake venom | Sigma | P0790 | Enzymatic assays |
| Phospholipase C Clostridium perfingrens | Sigma | P7633 | Enzymatic assays |
| Bis-p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 07422AH | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl stearate | Sigma | N3627 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl dodecanoate | Sigma | 61716 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl decanoate | Sigma | N0252 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl palmitate | Sigma | N2752 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl butyrate | Sigma | N9876 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl octanoate | Sigma | 21742 | Enzymatic assays |
| Acetic Acid, sodium salt [1-14C] | Perkin Elmer | NEC084 | Bacterial growth |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | JT Baker | 9224-01 | Enzymatic assays |
| Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. | Merck | 105547 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Spectrometer UV/VIS Lambda 35 | Perkin Elmer | NA | Enzymatic assays |
| Storm 820 Phosphorimager | Molecular Dynamics | NA | Photostimulable Luminescence scanner |
| Multipurpose Scintillation Counter | Beckman Coulter | NA | Radioactivity Quantification |
| French Pressure Cell | ThermoSpectronic | NA | Breakage of cells |
| chromatography paper 3MM Chr | Whatman | 3030917 | TLC analysis |
| Sinorhizobium meliloti 1021our | reference 34 | studied strain | |
| Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells | Novagen | 69451 | protein expression strain |
| pET9a vector | Novagen | 69431 | protein expression vector |
| pET17b vector | Novagen | 69663 | protein expression vector |
| sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon | Becton Dickinson | 352057 | radiolabeling of bacterial cultures |
| polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30125.15 | Enzymatic assays |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol | Sigma | D9135 | lipid standard |
| L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl | Sigma | P6267 | lipid standard |
| DL-α-monopalmitin | Sigma | M1640 | lipid standard |
| palmitic acid | Sigma | P0500 | lipid standard |
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