Summary

La definizione del substrato Specificità per lipasi e fosfolipasi candidati

Published: November 23, 2016
doi:

Summary

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

Abstract

I microrganismi producono un ampio spettro di lipasi (fosfo) che vengono secreti per rendere substrati esterni disponibili per l'organismo. In alternativa, altri (fosfo) lipasi possono essere fisicamente associate con l'organismo producendo causando un turnover di lipidi intrinseche e spesso dando origine ad un rimodellamento delle membrane cellulari. Sebbene potenziali (fosfo) lipasi possono essere previsti con un certo numero di algoritmi quando la sequenza del gene / proteina è disponibile, prova sperimentale delle attività enzimatiche, specificità di substrato e potenziali funzioni fisiologiche è spesso non è stata ottenuta. Questo manoscritto descrive l'ottimizzazione delle condizioni di analisi per i potenziali (fosfo) lipasi con specificità di substrato sconosciute e come impiegare queste condizioni ottimali nella ricerca per il substrato naturale di un rispettivo (fosfo) lipasi. Usando substrati cromogeni artificiali, come i derivati p -nitrophenyl, può aiutare a rilevare un minoreattività enzimatica per un (fosfo) lipasi previsto in condizioni standard. Avendo riscontrato un attività enzimatica tale minore, i parametri distinti di un saggio enzimatico possono essere variate per ottenere un'idrolisi più efficiente del substrato artificiale. Dopo aver determinato le condizioni in cui un enzima funziona bene, una varietà di potenziali substrati naturali devono essere analizzati per la loro degradazione, un processo che può essere seguita con metodi cromatografici distinti. La definizione di specificità di substrato per nuovi enzimi, fornisce spesso ipotesi per un potenziale ruolo fisiologico di questi enzimi, che poi possono essere testati sperimentalmente. Seguendo queste linee guida, siamo stati in grado di identificare una fosfolipasi C (SMc00171) che degrada fosfatidilcolina di phosphocholine e diacylglycerol, in una fase cruciale per il rimodellamento delle membrane nel batterio Sinorhizobium meliloti dalle condizioni di fosforo-limitante della crescita. Per due predetto patatin-come fosfolipasi (SMc00930 e SMc01003) dello stesso organismo, potremmo ridefinire le loro specificità di substrato e chiarire che SMc01003 è una lipasi diacilglicerolo.

Introduction

Lipidi glicerolo-based come trigliceridi e fosfolipidi (glycero) costituiscono importanti e probabilmente il più noti classi di lipidi 1. Trigliceridi (tag) sono grassi o oli, che di solito fungono da lipidi di stoccaggio, e quindi come potenziali fonti di energia e di carbonio. TAG possono essere degradati dalla lipasi, che sono spesso secrete dall'organismo produzione di digerire variabili esterne e renderli disponibili come fonti di carbonio. Inoltre, lipasi sono stati ampiamente studiati negli anni, grazie alle loro importanti applicazioni biotecnologiche 2.

A causa della loro natura anfifilica e la loro forma quasi cilindrica, proprietà di membrana formante (glycero) fosfolipidi esporre e generalmente costituiscono i principali componenti lipidici di membrana doppo strato 3. In microrganismi semplici, come il batterio Escherichia coli, solo tre varianti principali del gruppo testa, fosfatidilglicerolo (PG), cardiolipina (CL), e phosphatidylethanolamine (PE) è riscontrabile, anche se si deve essere consapevoli che ciascuno di essi può essere sostituito con un considerevole numero di differenti catene grassi acil al sn -1 o sn posizione -2 dando luogo ad un grande numero di differenti specie molecolari 4 . Altri batteri possono avere altri fosfolipidi in aggiunta o al posto. Ad esempio, Sinorhizobium meliloti, un batterio del suolo, che è in grado di formare una radice nodulo simbiosi azotofissatrice con l'erba medica legume (Medicago sativa), contiene in aggiunta al PE un secondo fosfolipide zwitterionico, fosfatidilcolina (PC) 5. Inoltre, i lipidi non contenenti fosforo o glicerolo potrebbe essere parte anfifilico e la forma della membrana cellulare. Ad esempio, dalle condizioni di crescita fosforo limitativo, in S. meliloti, (glycero) fosfolipidi sono in gran parte sostituiti da lipidi di membrana che non contengono fosforo, cioè, sulfolipids, lipidi ornitina, e diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. Nei batteri, DGTS è formata da diacilglicerolo (DAG) in un percorso in due fasi 7, ma la fonte per la generazione di DAG non era chiaro. Esperimenti di pulse-chase suggerito che il PC potrebbe essere un precursore per DGTS 8 e utilizzando la metodologia descritta in questo manoscritto abbiamo potuto identificare un fosfolipasi C (PLCP, SMc00171) che si forma in condizioni di fosforo-limitante e che può convertire il PC in DAG e phosphocholine 8.

In uno studio separato, abbiamo scoperto che un sintetasi acil-CoA (FADD) mutante -carente di S. meliloti o di Escherichia coli accumulato acidi grassi liberi entrando fase stazionaria della crescita 9. Sebbene questi acidi grassi sembravano essere derivato da lipidi di membrana, la fonte precisa per gli acidi grassi liberi o l'enzima (s) liberandoli non erano noti. Anche in questo caso, utilizzando la strategia delineata in questo manoscritto, due 10 (fosfo) lipasi Patatin-like (SMc00930 e SMc01003), che ha contribuito alla formazione di acidi grassi liberi a S. meliloti 11 sono stati previsti. Sorprendentemente, SMc01003 utilizzato DAG come substrato convertirlo monoacilglicerolo e infine glicerolo e acidi grassi liberi 11. Pertanto, SMc01003 è una lipasi DAG (DGLA).

Sebbene un certo numero di algoritmi esistenti per prevedere il potenziale (fosfo) lipasi 12,13, la loro funzione precisa e ruolo fisiologico non è generalmente noto. Qui descriviamo un protocollo, per clonare e iperespressione di lipasi (fosfo) previsti o potenziali. Questo manoscritto spiega come saggi enzimatici possono essere sviluppati e ottimizzati per la (fosfo) lipasi sovraespresso utilizzando substrati cromogeni artificiali. Forniamo esempi di come con un metodo enzimatico ottimizzato il vero (fosfo) substrato lipasi può essere incontrato e di come queste scoperte potrebbero arricchire la nostra comprensione della fisiologia microbica.

Protocol

1. Clone e iperespressione del gene strutturale per lipasi prevista Utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) 14 e oligonucleotidi specifici (Tabella 1) 15, amplificare il gene di interesse (smc01003, smc00930 o smc00171), previsto per codificare per una lipasi o fosfolipasi, dal DNA genomico dell'organismo ospite (ie , S. meliloti). Introdurre siti specifici di restrizione (con la sequenza creazione…

Representative Results

Attività di specifici PC fosfolipasi C SMc00171 con Bis- p -nitrophenyl fosfato Estratti privi di cellule ottenute da E. coli BL21 (DE3) pLysS x, che avevano smc00171 espressi, sono stati studiati per la loro capacità di idrolizzare bis- p esteri -nitrophenyl fosfato, utilizzando un saggio enzimatico spettrofotometrica, misurando la -NP <e…

Discussion

Nel corso degli ultimi 20 anni, genomi di molti organismi sono stati sequenziati e anche se una ricchezza di dati sequenza del genoma è stato generato, interpretazione funzionale è in ritardo e ostacola quindi la nostra comprensione della funzione del genoma. funzioni geniche in genomi sono spesso assegnati in base alla somiglianza con geni di funzione nota o di insorgenza di motivi conservati. Tuttavia, la precisa funzione di un dato gene spesso non è noto. Soprattutto, previsto geni strutturali per enzimi non posso…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-Messico (CONACYT-Messico) (82614, 153998, 253549, e 178.359 in Investigación Científica Básica e 118 in Investigación en Fronteras de la Ciencia) e dalla Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM DGAPA-; PAPIIT IN202616, IN203612).

Materials

Chloroform JT Baker 9180-03 TLC analysis & Lipid extraction
Methanol JT Baker 9070-03 TLC analysis & Lipid extraction
Acetic Acid JT Baker 9507-05 TLC analysis & Lipid extraction
Hexanes JT Baker 9309-02 TLC analysis & Lipid extraction
Diethylether Sigma 32203 Enzymatic assays
bidistilled water  ANY  NA Enzymatic assays
Tris Base Sigma T-1503 Enzymatic assays
HCl Baker 9535-02 Enzymatic assays
NaCl Baker 3624-01 Enzymatic assays
Triton X-100 Sigma X-100 Enzymatic assays
LB broth ANY NA Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water
tryptone Becton Dickinson and Company 211705 Bacterial growth
yeast extract Becton Dickinson and Company 212750 Bacterial growth
TY broth ANY NA Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water
CaCl2 2 H2O Baker 1332-01 Enzymatic assays
isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) Invitrogen 15529-019 Bacterial growth
Diethanolamine Sigma D-8885 Enzymatic assays
MnCl2 Sigma 221279 Enzymatic assays
Phospholipase A2 snake venom Sigma P0790 Enzymatic assays
Phospholipase C Clostridium perfingrens Sigma P7633 Enzymatic assays
Bis-p-nitrophenyl phosphate Sigma 07422AH Enzymatic assays
p-nitrophenyl stearate Sigma N3627 Enzymatic assays
p-nitrophenyl dodecanoate Sigma 61716 Enzymatic assays
p-nitrophenyl decanoate Sigma N0252 Enzymatic assays
p-nitrophenyl palmitate Sigma N2752 Enzymatic assays
p-nitrophenyl butyrate Sigma N9876 Enzymatic assays
p-nitrophenyl octanoate Sigma 21742 Enzymatic assays
Acetic Acid, sodium salt [1-14C] Perkin Elmer NEC084 Bacterial growth
dimethylsulfoxide (DMSO) JT Baker 9224-01 Enzymatic assays
Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. Merck 105547 TLC analysis & Lipid extraction
Spectrometer UV/VIS Lambda 35 Perkin Elmer NA Enzymatic assays
Storm 820 Phosphorimager Molecular Dynamics NA Photostimulable Luminescence scanner 
Multipurpose Scintillation Counter Beckman Coulter NA Radioactivity Quantification
French Pressure Cell ThermoSpectronic NA  Breakage of cells
chromatography paper 3MM Chr Whatman 3030917 TLC analysis
Sinorhizobium meliloti 1021our reference 34 studied strain
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells Novagen 69451 protein expression strain
pET9a vector Novagen 69431 protein expression vector
pET17b vector Novagen 69663 protein expression vector
sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon Becton Dickinson 352057 radiolabeling of bacterial cultures
polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) Eppendorf 30125.15 Enzymatic assays
1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol Sigma D9135 lipid standard
L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl Sigma P6267 lipid standard
DL-α-monopalmitin Sigma M1640 lipid standard
palmitic acid Sigma P0500 lipid standard

References

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Sahonero-Canavesi, D. X., Zavaleta-Pastor, M., Martínez-Aguilar, L., López-Lara, I. M., Geiger, O. Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates. J. Vis. Exp. (117), e54613, doi:10.3791/54613 (2016).

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