Lipaz ve Fosfolipaz Adayları için substrat özellikleri tanımlama
Summary
Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.
Abstract
Mikroorganizmalar organizma için dış yüzeyler kullanılabilir hale getirmek için salgılanan (fosfo) lipaz çok geniş bir yelpaze oluşturur. Alternatif olarak, diğer (fosfo) lipazlar fiziksel üreten organizma iç lipidlerin ciro sebep olması ve sıklıkla, hücre membranlarının bir biçimlenme sebebiyet veren ile ilişkili olabilir. potansiyeli (fosfor) lipazlar gen / protein dizisi mevcuttur algoritmaları bir dizi ile tahmin edilebilir, ancak, enzim aktiviteleri, alt-tabaka özgüllükleri ve potansiyel fizyolojik fonksiyonları deneysel kanıtı sıklıkla elde edilmemiştir. Bu yazıda bilinmiyor alt-tabaka özgüllükleri ve nasıl bir ilgili (fosfo) lipaz doğal alt-tabaka için arama, bu optimum koşulların kullanılması ile potansiyel (fosfo) lipazlar için Tayin koşullarının optimize edilmesi açıklanmaktadır. Küçük tespit etmek için yardımcı, p-nitrofenil türevleri gibi yapay kromojenik substratlar, olabilir kullanmaStandart koşullar altında bir tahmin (fosfo) lipaz için enzimatik aktivite. Böyle küçük bir enzimatik aktivite karşılaşmıştır, bir enzim tahlili ayrı parametre ile yapay alt tabaka daha verimli bir hidrolizi elde etmek için değiştiirlebilir. bir enzim çalışır koşulları tespit ettikten sonra, potansiyel, doğal substratlar, çeşitli tenzillerinden tat kromatografik yöntemler kullanılarak takip edilebilir bir işlem test edilmelidir. Yeni enzimler için alt-tabaka özgüllükleri tanımı, genellikle daha sonra deneysel olarak test edilebilir, bu enzimlerin, potansiyel bir fizyolojik rolü için hipotez içerir. Bu yönergeleri izleyerek, biz büyüme fosfor sınırlayıcı koşullara bağlı bakteri Sinorhizobium meliloti membranların remodeling için önemli bir adım olarak, fosfokoline ve diaçilgliserol için fosfatidilkolin bozan bir fosfolipaz C (SMc00171) tespit başardık. İki patatin- tahmin içinAynı organizmanın fosfolipaz (SMc00930 ve SMc01003) gibi, biz onların alt tabaka özgüllükleri yeniden tanımlamak ve SMc01003 bir diaçilgliserol lipaz olduğunu açıklamak olabilir.
Introduction
Bu tür triaçilgliserol ve (glisero) fosfolipidler gibi gliserol tabanlı lipidler önemli oluşturmaktadır ve muhtemelen en iyi bilinen lipit sınıfları 1. Triaçilgliseroller (TAG) yağlar ya da genellikle depolama lipidler olarak işlev yağlar, ve bu nedenle potansiyel enerji ve karbon kaynağı olarak bulunmaktadır. TAG'lar sık sık dış TAG sindirmek ve karbon kaynağı olarak kullanılabilir hale getirmek için üreten organizma tarafından salgılanan lipaz tarafından bozulmuş olabilir. Ayrıca, lipazlar yaygın nedeniyle önemli biyo teknolojik uygulamalarda 2 yıl içinde incelenmiştir.
Nedeniyle amfifilik doğası ve onların yakın silindirik şekil, (glisero) fosfolipidler sergi zar oluşturan özellikleri ve genellikle iki katmanlı membranın 3 ana lipidik bileşenlerini teşkil edecek. Bu bakteri Escherichia coli, sadece üç ana kafa grubu varyantları, fosfatidilgliserol (PG), kardiyolipin (CL) ve phosphatid basit mikroorganizmalardabunlardan biri, her biri farklı moleküler türler 4 çok sayıda bir sn farklı yağlı asil zincirleri önemli sayıda -1 ya da sn -2 pozisyonu veren artış ile ikame edilebilir bilmelidir, ancak ylethanolamine (PE), karşılaşılan . Diğer bakteriler diğer fosfolipidler ek olarak veya bunun yerine sahip olabilir. Örneğin, Sinorhizobium meliloti, baklagil yonca (Medicago sativa), bir azot bağlayıcı kök nodül simbiyoz oluşturmak için güçlü bir toprak bakterisi, ikinci bir zitteriyonik fosfolipid, fosfatidilkolin (PC), PE ilave olarak ihtiva eden 5 ile. Ayrıca, lipit içermeyen, fosfor veya gliserol, hücre zarının amfifilik ve form parçası olabilir. Örneğin, fosfor sınırlayıcı büyüme koşullarına bağlı olarak, S. meliloti (glisero) Fosfolipidler, büyük ölçüde, yani sulfolipidlerin, ornitin lipidler ve diacylglyceryl trimethylho fosfor içermeyen membran lipidleri ile ikame edilmektedirmoserine (DGTS) 6. Bakterilerde DGTS iki aşamalı yolun 7 diasilgliserole (DAG) teşekkül eden, fakat DAG üretimi için bir kaynak belli değildi edilir. Darbe kovalayıcı deneyler bilgisayar fosfor sınırlayıcı koşullar altında meydana geldiği ve DAG ve fosfokolin haline PC dönüştürmek olan DGTS 8 için bir ön-madde olarak ve bir fosfolipaz C (PLCP, SMc00171) tanımlayabilir Bu yazıda tarif edilen metodoloji kullanılarak düşündürmektedir 8.
Ayrı bir çalışmada, biz keşfettik bir açil-KoA sentetaz (fadd) S. -açıklı mutant büyüme 9 sabit faz girerken melılotı veya Escherichia coli serbest yağ asitleri birikmiş. Bu yağlı asitler, membran lipitleri elde edilecek gibi görünse de, serbest yağ asitleri ya da bunların serbest bırakılması enzim (ler) için kesin bir kaynak bilinmemektedir. Yine, bu stratejiyi uygulayan bu yazının ana hatlarıyla, iki patatin gibi 10 (fosfo) lipazlar (S. serbest yağ asitleri oluşmasına katkıda SMc00930 ve SMc01003) meliloti 11 tahmin edildi. Şaşırtıcı bir şekilde, SMc01003 o gliserol ve serbest yağ asitleri 11 nihayet monoaçilgliserol ve dönüştürme substrat olarak DAG kullanıldı. Bu nedenle, SMc01003 DAG lipazı (DGLA) 'dir.
Algoritmaları bir dizi potansiyel (fosforo) tahmin etmek için mevcut olmakla beraber 12,13, lipazlar onların hassas fonksiyon ve fizyolojik rolü genellikle bilinmemektedir. Burada klonlamak, bir protokol anahat ve tahmin veya potansiyel (fosfo) lipazlar aşın. Bu el yazması enzim tahlilleri geliştirilmiş ve yapay kromojenik maddeleri kullanarak aşırı (fosfo) lipaz için optimize edilebilir açıklar. Bu bulguların mikrobiyal fizyoloji anlayışımızı zenginleştirecek nasıl optimize edilmiş bir enzim testi ile gerçek (fosfo) lipaz substrat karşılaştı olabilir ve nasıl örnekler sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son 20 yılda, birçok organizmanın genomu dizilimi edilmiş ve genom dizisi verilerin bir zenginlik üretilen olmasına rağmen, fonksiyonel yorumlama geride ve bu nedenle genom fonksiyonunun anlayışımızı engellemektedir edilir. genomları Gen fonksiyonları genellikle bilinen işlev veya korunmuş motiflerinin oluşum genlerine benzerliğine dayalı atanır. Bununla birlikte, belirli bir genin tam işlevi genellikle bilinmez. Özellikle, enzimler için yapısal genler nedeniyle kolaylıkla en enzimler iki yüzey…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser (Investigación en Fronteras de la Ciencia de Investigación Científica BasicA 82614, 153998, 253549, ve 178359 yanı sıra 118) ve Dirección Genel de Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-Meksika) hibe ile desteklenmiştir (DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616, IN203612) asuntos de Kişisel Académico-Universidad Nacional Autonoma de México.
Materials
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Methanol | JT Baker | 9070-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Acetic Acid | JT Baker | 9507-05 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Hexanes | JT Baker | 9309-02 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Diethylether | Sigma | 32203 | Enzymatic assays |
| bidistilled water | ANY | NA | Enzymatic assays |
| Tris Base | Sigma | T-1503 | Enzymatic assays |
| HCl | Baker | 9535-02 | Enzymatic assays |
| NaCl | Baker | 3624-01 | Enzymatic assays |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | Enzymatic assays |
| LB broth | ANY | NA | Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water |
| tryptone | Becton Dickinson and Company | 211705 | Bacterial growth |
| yeast extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | Bacterial growth |
| TY broth | ANY | NA | Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water |
| CaCl2 2 H2O | Baker | 1332-01 | Enzymatic assays |
| isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529-019 | Bacterial growth |
| Diethanolamine | Sigma | D-8885 | Enzymatic assays |
| MnCl2 | Sigma | 221279 | Enzymatic assays |
| Phospholipase A2 snake venom | Sigma | P0790 | Enzymatic assays |
| Phospholipase C Clostridium perfingrens | Sigma | P7633 | Enzymatic assays |
| Bis-p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 07422AH | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl stearate | Sigma | N3627 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl dodecanoate | Sigma | 61716 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl decanoate | Sigma | N0252 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl palmitate | Sigma | N2752 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl butyrate | Sigma | N9876 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl octanoate | Sigma | 21742 | Enzymatic assays |
| Acetic Acid, sodium salt [1-14C] | Perkin Elmer | NEC084 | Bacterial growth |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | JT Baker | 9224-01 | Enzymatic assays |
| Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. | Merck | 105547 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Spectrometer UV/VIS Lambda 35 | Perkin Elmer | NA | Enzymatic assays |
| Storm 820 Phosphorimager | Molecular Dynamics | NA | Photostimulable Luminescence scanner |
| Multipurpose Scintillation Counter | Beckman Coulter | NA | Radioactivity Quantification |
| French Pressure Cell | ThermoSpectronic | NA | Breakage of cells |
| chromatography paper 3MM Chr | Whatman | 3030917 | TLC analysis |
| Sinorhizobium meliloti 1021our | reference 34 | studied strain | |
| Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells | Novagen | 69451 | protein expression strain |
| pET9a vector | Novagen | 69431 | protein expression vector |
| pET17b vector | Novagen | 69663 | protein expression vector |
| sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon | Becton Dickinson | 352057 | radiolabeling of bacterial cultures |
| polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30125.15 | Enzymatic assays |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol | Sigma | D9135 | lipid standard |
| L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl | Sigma | P6267 | lipid standard |
| DL-α-monopalmitin | Sigma | M1640 | lipid standard |
| palmitic acid | Sigma | P0500 | lipid standard |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M. . Lehninger, Principles of Biochemistry. , (2013).
- Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
- Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 1-37 (2008).
- Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?. Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).
- De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).
- Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti. Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).
- Klug, R. M., Benning, C. Two enzymes of diacylglyceryl-O-4′-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).
- Zavaleta-Pastor, M., et al. Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).
- Pech-Canul, A., et al. FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids. J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).
- Banerji, S., Flieger, A. Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?. Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).
- Sahonero-Canavesi, D. X., et al. Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase. Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).
- Fischer, M., Pleiss, J. The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families. Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).
- Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucl. Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
- Miller, J. H. . Experiments in Molecular Genetics. , (1972).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).
- Molecular Dynamics. . Phosphorimager SI User´s Guide. , (1994).
- Dixon, M., Webb, E. . Enzymes: Third Edition. , (1979).
- Rudolph, A. E., et al. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member. J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).
- Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).
- Peppelenbosch, M. P. Kinome profiling. Scientifica (Cairo). , (2012).
- Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).
- Kuznetsova, E., et al. Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).
- Scopes, R. K. . Protein Purification, Principles and Practice. , (2010).
- Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).
