Summary

Definindo substrato Especificidades para a lipase e fosfolipase candidatos

Published: November 23, 2016
doi:

Summary

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

Abstract

Microorganismos produzem um largo espectro de lipases (fosfo) que são secretadas, a fim de fazer substratos externos disponível para o organismo. Alternativamente, outros (fosfo) lipase pode ser fisicamente associado com o organismo produtor causando uma rotação de lípidos intrínsecas e frequentemente dando origem a uma remodelação das membranas celulares. Embora potenciais (fosfo) lipase pode ser previsto com um certo número de algoritmos quando a sequência do gene / proteína está disponível, não tem frequentemente sido obtida prova experimental das actividades enzimáticas, especificidades de substrato, e funções fisiológicas potenciais. Este manuscrito descreve a optimização das condições de ensaio para a (fosfo) lipase prospectivos com especificidades de substrato desconhecidos e como empregar estas condições optimizadas na pesquisa para o substrato natural de um respectivo (fosfo) lipase. Usando substratos cromogénicos artificiais, tais como derivados de p-nitrofenilo, pode ajudar a detectar uma menoractividade enzimática para um (fosfo) lipase previsto, sob condições padrão. Tendo encontrado uma actividade enzimática, tais menor, os parâmetros distintos de um ensaio de enzima podem ser variados de modo a obter uma hidrólise mais eficiente do substrato artificial. Depois de ter determinado as condições sob as quais uma enzima funciona bem, uma variedade de substratos naturais potenciais devem ser ensaiadas quanto à sua degradação, um processo que pode ser seguido utilizando métodos cromatográficos diferentes. A definição das especificidades de substrato para enzimas novas, frequentemente fornece hipóteses para um potencial papel fisiológico destas enzimas, que podem então ser testados experimentalmente. Seguindo essas orientações, fomos capazes de identificar uma fosfolipase C (SMc00171) que degrada fosfatidilcolina para fosfocolina e diacilglicerol, em um passo crucial para a remodelação das membranas na bactéria Sinorhizobium meliloti das condições de limitação de fósforo de crescimento. Para duas previu patatin-como fosfolipases (SMc00930 e SMc01003) do mesmo organismo, que poderia redefinir suas especificidades de substrato e esclarecer que SMc01003 é uma lipase diacilglicerol.

Introduction

Lípidos à base de glicerol como triglicerídeos e fosfolipídios (glicero) constituem importante e, provavelmente, as classes de lípidos mais conhecidos 1. Triacilgliceróis (tags) são as gorduras e óleos, que normalmente funcionam como lipídios de armazenamento e, portanto, como potenciais fontes de energia e de carbono. As tags podem ser degradados por lipases, que são frequentemente segregadas pelo organismo produtor de digerir TAGs externas e torná-los disponíveis como fontes de carbono. Além disso, lipases têm sido amplamente estudados ao longo dos anos devido às suas importantes aplicações biotecnológicas 2.

Devido à sua natureza anfifílica e sua forma quase cilíndrica, propriedades de formação de membrana (glicero) fosfolipídios de exposição e normalmente constituem os principais componentes lipídicos de uma membrana de bicamada 3. Em microorganismos simples, tais como a bactéria Escherichia coli, apenas três variantes principais grupo de cabeça, fosfatidilglicerol (PG), a cardiolipina (CL), e phosphatidylethanolamine (PE) são encontrados, embora se deva ter presente que cada um deles pode ser substituído com um número considerável de diferentes cadeias de acilo gordo na posição sn-1 ou sn posição -2 dando origem a um grande número de diferentes espécies moleculares 4 . Outras bactérias pode ter outros fosfolipídios em adição ou em vez disso. Por exemplo, Sinorhizobium meliloti, uma bactéria do solo, que é capaz de formar uma simbiose nódulo da raiz de fixação de azoto, com a alfafa de leguminosas (Medicago sativa), contém, além de um segundo fosfolípido PE zwitteriónico, fosfatidilcolina (PC) 5. Além disso, os lipídios não contendo fósforo ou glicerol pode ser anfifílico e fazem parte da membrana celular. Por exemplo, em condições de crescimento limitativos de fósforo, em S. meliloti, (glicero) fosfolípidos são em grande parte substituído por lípidos da membrana que não contêm fósforo, ou seja, os sulfolípidos, lípidos ornitina, e diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. Em bactérias, DGTS é formado a partir de diacilglicerol (DAG) em uma via de duas etapas 7, mas a fonte para geração de DAG não foi claro. Experimentos pulse-chase sugeriu que o PC pode ser um precursor para DGTS 8 e utilizando a metodologia descrita neste manuscrito foi possível identificar uma fosfolipase C (PLCP, SMc00171) que é formado sob condições limitantes de fósforo e que pode converter PC em DAG e fosfocolina 8.

Em um estudo separado, descobrimos que uma sintetase de acil-CoA (FADD) -deficient mutante de S. meliloti ou de Escherichia coli acumulada ácidos graxos livres ao entrar em fase estacionária de crescimento de 9. Embora estes ácidos gordos pareceu ser derivados de lípidos da membrana, a origem exacta para os ácidos gordos livres ou a enzima (s) libertando-os não eram conhecidos. Mais uma vez, empregando a estratégia delineada neste manuscrito, dois 10 (fosfo) lipases patatina-like (SMc00930 e SMc01003) que contribuiu para a formação de ácidos gordos livres em S. meliloti 11 foram previstos. Surpreendentemente, SMc01003 DAG utilizado como substrato para convertê-lo e, finalmente, monoacilglicerol glicerol e ácidos gordos livres 11. Por conseguinte, é uma lipase SMc01003 DAG (DGLA).

Embora um número de algoritmos de previsão do potencial existe (fosfo) lipases 12,13, a sua função precisa e papel fisiológico normalmente não é conhecido. Aqui destacamos um protocolo, clonar e sobre-expressar lipases (fosfo) previstos ou potenciais. Este manuscrito explica como ensaios de enzimas pode ser desenvolvido e optimizado para o (fosfo) lipase sobre-expresso utilizando substratos cromogénicos artificiais. Nós fornecemos exemplos como com um ensaio enzimático otimizado do real (fosfo) lipase substrato podem ser encontradas e como estas descobertas podem enriquecer a nossa compreensão da fisiologia microbiana.

Protocol

1. O clone e gene estrutural para sobre-expressar a lipase Previsto Usando reacção em cadeia da polimerase (PCR) 14 e oligonucleótidos específicos (Tabela 1) 15, amplificar o gene de interesse (smc01003, smc00930, ou smc00171), previsto para codificar para uma lipase ou fosfolipase, a partir do ADN genómico do organismo hospedeiro (ou seja , S. meliloti). Introduzir locais específicos de restrição (com a sequ?…

Representative Results

Actividade de Fosfolipase específico para PC C SMc00171 com bis-p-nitrofenil fosfato Extractos isentos de células obtidos a partir de E. coli BL21 (DE3) pLysS x, que tinha smc00171 expressa, foram estudados quanto à sua capacidade para hidrolisar ésteres de fosfato de bis-p-nitrofenilo, utilizando um ensaio espectrofotom…

Discussion

Nos últimos 20 anos, os genomas de muitos organismos já foram seqüenciados e, apesar de uma riqueza de dados seqüência do genoma foi gerado, interpretação funcional está ficando para trás e, portanto, dificulta a nossa compreensão da função do genoma. funções dos genes em genomas são frequentemente atribuídos com base na similaridade com genes de função ou a ocorrência de motivos conservados conhecido. No entanto, a função exacta de um determinado gene, muitas vezes não é conhecido. Especialmente,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por doações do Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-México) (82614, 153998, 253549 e 178359 em Investigación Científica Básica, bem como 118 em Investigación en Fronteras de la Ciencia) e da Dirección General de Asuntos de pessoal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM DGAPA-; PAPIIT IN202616, IN203612).

Materials

Chloroform JT Baker 9180-03 TLC analysis & Lipid extraction
Methanol JT Baker 9070-03 TLC analysis & Lipid extraction
Acetic Acid JT Baker 9507-05 TLC analysis & Lipid extraction
Hexanes JT Baker 9309-02 TLC analysis & Lipid extraction
Diethylether Sigma 32203 Enzymatic assays
bidistilled water  ANY  NA Enzymatic assays
Tris Base Sigma T-1503 Enzymatic assays
HCl Baker 9535-02 Enzymatic assays
NaCl Baker 3624-01 Enzymatic assays
Triton X-100 Sigma X-100 Enzymatic assays
LB broth ANY NA Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water
tryptone Becton Dickinson and Company 211705 Bacterial growth
yeast extract Becton Dickinson and Company 212750 Bacterial growth
TY broth ANY NA Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water
CaCl2 2 H2O Baker 1332-01 Enzymatic assays
isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) Invitrogen 15529-019 Bacterial growth
Diethanolamine Sigma D-8885 Enzymatic assays
MnCl2 Sigma 221279 Enzymatic assays
Phospholipase A2 snake venom Sigma P0790 Enzymatic assays
Phospholipase C Clostridium perfingrens Sigma P7633 Enzymatic assays
Bis-p-nitrophenyl phosphate Sigma 07422AH Enzymatic assays
p-nitrophenyl stearate Sigma N3627 Enzymatic assays
p-nitrophenyl dodecanoate Sigma 61716 Enzymatic assays
p-nitrophenyl decanoate Sigma N0252 Enzymatic assays
p-nitrophenyl palmitate Sigma N2752 Enzymatic assays
p-nitrophenyl butyrate Sigma N9876 Enzymatic assays
p-nitrophenyl octanoate Sigma 21742 Enzymatic assays
Acetic Acid, sodium salt [1-14C] Perkin Elmer NEC084 Bacterial growth
dimethylsulfoxide (DMSO) JT Baker 9224-01 Enzymatic assays
Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. Merck 105547 TLC analysis & Lipid extraction
Spectrometer UV/VIS Lambda 35 Perkin Elmer NA Enzymatic assays
Storm 820 Phosphorimager Molecular Dynamics NA Photostimulable Luminescence scanner 
Multipurpose Scintillation Counter Beckman Coulter NA Radioactivity Quantification
French Pressure Cell ThermoSpectronic NA  Breakage of cells
chromatography paper 3MM Chr Whatman 3030917 TLC analysis
Sinorhizobium meliloti 1021our reference 34 studied strain
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells Novagen 69451 protein expression strain
pET9a vector Novagen 69431 protein expression vector
pET17b vector Novagen 69663 protein expression vector
sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon Becton Dickinson 352057 radiolabeling of bacterial cultures
polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) Eppendorf 30125.15 Enzymatic assays
1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol Sigma D9135 lipid standard
L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl Sigma P6267 lipid standard
DL-α-monopalmitin Sigma M1640 lipid standard
palmitic acid Sigma P0500 lipid standard

References

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Sahonero-Canavesi, D. X., Zavaleta-Pastor, M., Martínez-Aguilar, L., López-Lara, I. M., Geiger, O. Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates. J. Vis. Exp. (117), e54613, doi:10.3791/54613 (2016).

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