طرق لدراسة الدهون التعديلات في العدلات وتشكيل لاحقة من الفخاخ خارج الخلية العدلات
Summary
ومن المعروف أن الدهون تلعب دورا هاما في الوظائف الخلوية. هنا، نحن تصف طريقة لتحديد تكوين الدهون العدلات، مع التركيز على مستوى الكوليسترول في الدم، باستخدام كل HPTLC وHPLC للحصول على فهم أفضل للآليات الكامنة وراء العدلات تشكيل فخ خارج الخلية.
Abstract
تحليل الدهون التي يقوم بها عالية الأداء اللوني طبقة رقيقة (HPTLC) هو طريقة بسيطة نسبيا فعالة من حيث التكلفة لتحليل مجموعة واسعة من الدهون. تم الإبلاغ عن وظيفة الدهون (على سبيل المثال، في التفاعلات المضيف الممرض أو دخول المضيف) للعب دورا حاسما في العمليات الخلوية. هنا، وتبين لنا طريقة لتحديد تركيبة الدهون، مع التركيز على مستوى الكولسترول العدلات المشتقة من الدم الأولية، عن طريق HPTLC بالمقارنة مع الأداء العالي اللوني السائل (HPLC). وكان الهدف هو تحقيق دور التعديلات الدهون / الكوليسترول في تشكيل الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة). ومن المعروف الإفراج NET كآلية دفاع المضيف لمنع الجراثيم من الانتشار داخل المضيف. لذلك، تم علاج العدلات الإنسان المستمدة من الدم مع ميثيل β-السيكلودكسترين (MβCD) للحث على التعديلات الدهون في الخلايا. عن طريق HPTLC وHPLC، لقد أظهرنا أن العلاج MβCD الخلايا يؤدي إلى الدهونالتعديلات المرتبطة انخفاض كبير في محتوى الكوليسترول الخلية. وفي الوقت نفسه، أدت المعاملة MβCD من العدلات إلى تشكيل المستجدة، كما يتضح من الفحص المجهري المناعي. وخلاصة القول، هنا نقدم طريقة مفصلة لدراسة التعديلات الدهون في العدلات وتشكيل المستجدة.
Introduction
وقد ثبت الدهون لتلعب دورا هاما في توازن الخلايا، وموت الخلايا والتفاعلات المضيف الممرض، وإطلاق سراح خلوى 1. مع مرور الوقت، زادت الفائدة والمعرفة حول تأثير الدهون في التفاعلات المضيف الممرض أو التهاب، والعديد من المنشورات تأكيد الدور المحوري لبعض الدهون، خصوصا الكوليسترول الستيرويد، في الاستجابات الخلوية. العلاج الدوائي مع الستاتين، والتي تستخدم باسم مثبطات الكولسترول الحيوي من خلال منع 3-هيدروكسي-3-methylglutaryl-coenzym-A-اختزال (HMG-لجنة الزراعة اختزال)، يمكن أن تعمل كوكلاء المضادة للالتهابات عن طريق خفض مستويات المصل من انترلوكين (6) وبروتين سي التفاعلي (2). الكولسترول والهياكل التخصيب glycosphingolipid يمكن استخدامها من قبل العديد من مسببات الأمراض، مثل البكتيريا والفيروسات، كبوابة إلى المضيف 3، 4، 5،الطبقة = "XREF"> 6. الإسفنجية (على سبيل المثال، سفينغوميالين) وقد ثبت أن استخدامها من قبل مسببات الأمراض من أجل تعزيز المرضية من 7. في الضامة، واستخدام المتفطرات المجالات للدخول خلايا الكولسترول إثراء؛ استنزاف الكولسترول يمنع امتصاص الفطرية 8. وعلاوة على ذلك، أدى إصابة الضامة مع الفرنسيسيلة التولارية، وكيل الحيوانية مسؤولة عن حمى الأرانب (المعروف أيضا باسم حمى الأرانب) 9، لالعدوى التي ألغيت عندما تم المنضب الكولسترول من الأغشية 10. وبالمثل، وقد تجلى غزو الخلايا المضيفة التي كتبها القولونية عبر الهياكل غنية بالدهون لتكون 4 تعتمد على الكولسترول. وعلاوة على ذلك، أظهرت التجارب السالمونيلا التيفية الفأرية العدوى من الخلايا الظهارية أن الكوليسترول ضروري للدخول الممرض إلى خلايا 11. الكولسترول استنزاف inhibiteد الإقبال على السالمونيلا 11. وعلاوة على ذلك، أظهرت دراسة حديثة أجرتها Gilk وآخرون. أظهرت أن الكولسترول يلعب دورا هاما في امتصاص كوكسيلة بورنيتية 12. بالإضافة إلى ذلك، تونغ وآخرون. وجدت أن 25 hydroxycholesterol يلعب دورا حاسما في البلعمة من قبل lipopolysaccharide في (LPS) -stimulated الضامة (13). تم تخفيض البلعمة عندما الضامة المعالجة الدوائية في استنزاف الكولسترول 14. وهكذا، والكولسترول والدهون الأخرى يبدو أن تلعب دورا هاما في العدوى والالتهابات، ومنذ نضوبها يمكن أن تقلل من خطر الغزو من عدة مسببات 10 و 11 و 12.
في الآونة الأخيرة، كنا قادرين على إظهار أن التعديلات الدهون، وخاصة استنزاف الكولسترول من الخلايا، لحث على تشكيل extracellula العدلةالفخاخ ص (المستجدة) في العدلات المشتقة من الدم البشري 15. منذ اكتشاف المستجدة في عام 2004، وقد ثبت أن يلعب أدوارا حاسمة في فخ البكتيريا، وبالتالي في إعاقة انتشار العدوى 16 و 17. تتكون المستجدة من العمود الفقري الحمض النووي المرتبطة الهستونات، البروتياز، والببتيدات المضادة للميكروبات 16. الافراج عن المستجدة التي كتبها العدلات يمكن الناجمة عن غزو الجراثيم 18 و 19 و المواد الكيميائية مثل phorbol-ميريستيت-خلات (PMA) أو العقاقير المخفضة للكوليسترول 16 و 20. ومع ذلك، فإن الآليات الخلوية مفصلة، وخصوصا دور الدهون في هذه العملية، لا تزال غير واضحة تماما. تحليل الدهون يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للآليات المشاركة في مجموعة واسعة من العمليات والتفاعلات الخلوية، مثل إطلاق سراح المستجدة. Cholesteرول وسفينغوميالين مقومات الحيوية للغشاء الخلية والدهون microdomains، حيث يضيفون الاستقرار وتسهيل تجميع البروتينات المتورطين في الاتجار البروتين ويشير أحداث 21. للتحقيق في دور الآلية من بعض الدهون، وكلاء الدوائية محبة للجهتين مثل قليل السكاريد دوري ميثيل β-السيكلودكسترين (MβCD)، ويمكن استخدامها لتغيير تركيبة الدهون من الخلايا وتقليل الكولسترول في المختبر 15. هنا، فإننا نقدم وسيلة لاستخدام HPTLC لتحليل تكوين الدهون العدلات ردا على MβCD. وقد استخدم HPLC لتأكيد مستوى الكولسترول في عدد العدلات. وعلاوة على ذلك، نحن تصف طريقة لتصور تشكيل المستجدة بواسطة المجهر المناعي في العدلات المشتقة من الدم البشري ردا على MβCD.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب المذكورة هنا يمكن استخدامها لتحليل الدهون محددة، مثل الكولسترول، عن طريق HPTLC أو HPLC والتحقيق في آثار التعديلات الدهون الدوائية على تشكيل المستجدة (انظر نيومان وآخرون 15).
HPTLC هو طريقة فعالة من حيث التكلفة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل زمالة أكاديمي FÜR Tiergesundheit (AFT) وزمالة من برنامج الدكتوراه، "الحيوانية والحيوانية المنشأ التهابات،" من جامعة الطب البيطري، هانوفر، ألمانيا، شريطة أن أريان نيومان.
Materials
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright, ., J, S. N., Abraham, The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. . Dermatology 2-Volume Set. , (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori’s cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity – A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses?. Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
