Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Summary

Lipids sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle bei der zellulären Funktionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode, um die Lipidzusammensetzung von Neutrophilen, um zu bestimmen, wobei der Schwerpunkt auf dem Cholesterinspiegel, sowohl durch HPTLC und HPLC mit einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der neutrophilen extrazellulären Falle Bildung zu gewinnen.

Abstract

Lipid-Analyse durch Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie durchgeführt (HPTLC) ist ein relativ einfaches, kostengünstiges Verfahren zur Herstellung eine breite Palette von Lipiden analysiert. Die Funktion von Lipiden ( zum Beispiel in der Wirt-Pathogen – Interaktionen oder Host – Eintrag) wurde eine entscheidende Rolle bei zellulären Prozessen spielen gemeldet. Hier zeigen wir ein Verfahren Lipidzusammensetzung, um zu bestimmen, mit dem Fokus auf dem Cholesterinspiegel des primären Blut abgeleiteten Neutrophilen, durch HPTLC im Vergleich zur Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). Ziel war es, die Rolle der Lipid / Cholesterin Veränderungen bei der Bildung von Neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) zu untersuchen. NET-Release wird als Abwehrmechanismus bekannt Erreger zu verhindern innerhalb des Host-Ausbreitung. Daher Blut gewonnenen humanen Neutrophilen wurden mit Methyl-β-cyclodextrin (MßCD) behandelt, um Lipidveränderungen in den Zellen zu induzieren. Mit HPTLC und HPLC haben wir gezeigt, dass MßCD Behandlung der Zellen zu Lipid führtmit einer signifikanten Verringerung des Cholesteringehalt der Zelle verbunden sind Veränderungen. Zur gleichen Zeit, MßCD Behandlung der Neutrophilen führte zur Bildung von NETs, ​​wie durch Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt. Zusammenfassend hier präsentieren wir eine detaillierte Methode Lipid Veränderungen in Neutrophilen und die Bildung von NETs zu studieren.

Introduction

Lipids wurden ¹ eine wichtige Rolle in Zellhomöostase, Zelltod, Wirt-Pathogen – Interaktionen und Zytokin – Freisetzung gezeigt spielen. Im Laufe der Zeit das Interesse für und das Wissen über die Auswirkungen von Lipiden in der Wirt-Pathogen-Interaktionen oder Entzündung haben zugenommen, und mehrere Publikationen bestätigen die zentrale Rolle bestimmter Lipide, vor allem das Steroid Cholesterin, in zellulären Antworten. Pharmakologische Behandlung mit Statinen, die durch die Blockierung 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase) als Inhibitoren der Cholesterin-Biosynthese verwendet werden, können als entzündungshemmende Mittel wirken, indem sie die Serumspiegel von Interleukin Senkung 6 und C-reaktives Protein ^2. Cholesterin- und Glycosphingolipid angereicherten Strukturen können durch verschiedene Pathogene, wie Bakterien und Viren verwendet werden, als Gateway in das Wirts ^{3, 4, 5,}class = "xref"> 6. Sphingolipide (zB Sphingomyelin) wurde von Pathogenen verwendet gezeigt werden , um ihre Pathogenität ⁷ zu fördern. In Makrophagen, Mykobakterien Verwendung Domänen-Cholesterin angereicherten Zellen für die Eingabe; ein Abbau von Cholesterin hemmt Mykobakterien – Aufnahme ^8. Weiterhin Infektion von Makrophagen mit Francisella tularensis, einem Zoonoseerregers verantwortlich für Tularämie (auch als Kaninchen Fieber bekannt) ^9, führte zu einer Infektion , die aufgehoben wurde , wenn Cholesterin aus den Membranen ¹⁰ aufgebraucht wurde. In ähnlicher Weise wurde die Invasion von Wirtszellen durch Escherichia coli über lipidreichen Strukturen demonstriert Cholesterin-abhängige ⁴ sein. Darüber hinaus zeigten S. typhimurium Infektionsversuche von Epithelzellen , dass Cholesterin für Erreger Eintritt in die Zellen ¹¹ wesentlich ist. Cholesterin Verarmungs inhibited die Aufnahme von Salmonella – ^11. Ferner ist eine aktuelle Studie von Gilk et al. gezeigt , dass Cholesterin ¹² eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Coxiella burnetii spielt. Zusätzlich Tuong et al. festgestellt , dass 25-hydroxycholesterol spielt stimulierte eine entscheidende Rolle bei der Phagozytose durch Lipopolysaccharide (LPS) Makrophagen ^13. Phagozytose reduziert wurde , wenn pharmakologisch Makrophagen Cholesterin ¹⁴ verarmen behandelt wurden. So Cholesterin und andere Lipide scheinen eine wichtige Rolle bei Infektionen und Entzündungen zu spielen, da ihre Erschöpfung des Risiko einer Invasion von mehreren Erregern ^{10, 11} zu ^{reduzieren, 12.}

Vor kurzem konnten wir feststellen, dass Lipid-Veränderungen zeigen, vor allem den Abbau von Cholesterin aus der Zelle, induziert die Bildung von neutrophilen Extrazellulärr Fallen (NETS) in menschlichem Blut abgeleitetes Neutrophile ^15. Seit der Entdeckung von NETs im Jahr 2004 wurde sie gezeigt entscheidende Rolle bei der bakteriellen Einschluss zu spielen und damit in behindern die Ausbreitung der Infektion ^{16, 17.} NETs besteht aus einem DNA – Rückgrat mit Histonen, Proteasen assoziiert und antimikrobielle Peptide ^16. Die Freisetzung des NETs durch Neutrophile durch eindringende Krankheitserreger ^{18, 19} und chemische Substanzen wie Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) oder Statine ^{16, 20} induziert werden. Allerdings sind die detaillierten zellulären Mechanismen, und vor allem die Rolle von Lipiden in diesem Verfahren sind noch nicht ganz klar. Die Analyse von Lipiden kann in einer Vielzahl von zellulären Prozessen und Interaktionen, wie zB die Freisetzung von NETs beteiligt zu einem besseren Verständnis der Mechanismen führen. Cholesterol und Sphingomyelin sind wichtige Bestandteile der Zellmembran und Lipid – Mikrodomänen, in denen sie die Stabilität hinzuzufügen und die Clusterbildung der in den Proteintransport und Signalereignisse ²¹ beteiligten Proteine zu erleichtern. Um die mechanistische Rolle bestimmter Lipiden, amphiphilen pharmakologischer Mittel, wie die cyclische Oligosaccharid Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) zu untersuchen , kann verwendet werden , um die Lipidzusammensetzung einer Zelle zu verändern , und zur Verringerung von Cholesterin in vitro ^15. Hier präsentieren wir eine Methode HPTLC zu verwenden, um die Lipidzusammensetzung von Neutrophilen in Reaktion auf MßCD zu analysieren. HPLC wurde verwendet, um das Niveau des Cholesterins in der neutrophilen Population zu bestätigen. Weiterhin beschreiben wir ein Verfahren, um die Bildung von NETs durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie in menschlichem Blut abgeleiteten Neutrophilen als Reaktion auf MßCD sichtbar zu machen.

Protocol

Die Sammlung des peripheren Blutes in diesem Protokoll wurde von der lokalen Menschenforschungsethikkommission genehmigt. Alle menschlichen Probanden, wenn ihr eine schriftliche Einverständniserklärung. 1. Isolierung von humanen blutabgeleiteten Neutrophilen durch Dichtegradientenzentrifugation Isolierung von menschlichem Blut abgeleitetes Neutrophile Schicht ~ 20 ml Blut auf 20 ml Natriumdiatrizoat / Dextran-Lösung in der Nähe einer Flamme und ohne s…

Representative Results

Humanblut abgeleitetes Neutrophile wurden durch Dichtegradientenzentrifugation (Abbildung 2) isoliert. Um die Wirkung von Lipid-Veränderungen auf Neutrophilen zu untersuchen, wurden die Zellen mit 10 mM MßCD behandelt, der Cholesterin aus der Zelle verarmt. Anschließend wurden die Lipide aus den Proben von Bligh und Dyer (1, linkes Feld) isoliert, wie von Brogden et al. 23. Die hergestellten Lipidproben wurden auf Kies…

Discussion

Die hier beschriebenen Methoden können verwendet werden , um bestimmte Lipide zu analysieren, wie Cholesterin, durch HPTLC oder HPLC und die Auswirkungen der pharmakologischen Lipidveränderungen auf der Bildung von NETs zu untersuchen (siehe Neumann et al. ^15).

HPTLC ist eine relativ kostengünstige und einfache Methode, ein breites Spektrum von Lipiden in einer großen Anzahl von Proben zu analysieren. Dieses Verfahren wurde in vielen Forschungsgebieten, e…

Materials

Neutrophil isolation, NET staining and quantification
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen	A-21070
Anti-MPOα antibody	Dako	A0398
BSA	Sigma-Aldrich	3912-100G
Marienfeld-Neubauer improved counting chamber	Celeromics	MF-0640010
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner	Leica	DMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10X	Sigma-Aldrich	P5493-1L	Dilute 1:10 in water for 1X working solution
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed	Thermo Fisher Scientific	35503
Excel	Microsoft	2010
DNA/Histone 1 antibody	Millipore	MAB3864
Image J	NIH	1.8	http://imagej.nih.gov/ij/
Light microscope	VWR	630-1554
Methyl-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	C4555-1G
PFA	Carl Roth	0335.3	dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution
PMA	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Polymorphprep	AXIS-SHIELD	AN1114683
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent	Invitrogen	P7581
RPMI1640	PAA	E 15-848
HBSS with CaCl and Mg	Sigma	H6648
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ml
Trypanblue	Invitrogen	15250-061	0.4% solution
Water	Carl Roth	3255.1	endotoxin-free
Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipid isolation and analysis
1-propanol	Sigma-Aldrich	33538
10 µl syringe	Hamilton	701 NR 10 µl
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	346136
Ethyl acetate	Carl Roth	7336.2
Canullla 26G	Braun	4657683
Copper(II)sulphatepentahydrate	Merck	1027805000
Chloroform	Carl Roth	7331.1
CP ATLAS software	Lazarsoftware	2.0
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column	Merck	152022
High Performance Liquid Chromatograph Chromaster	Hitachi	HITA 892-0080-30Y	Paramaters are dependent on individual HPLC machine
HPLC UV Detector	Hitachi	5410
HPLC Column Oven	Hitachi	5310
HPLC Auto Sampler	Hitachi	5260
HPLC Pump	Hitachi	5160
Methanol	Carl Roth	7342.1
n-Hexane	Carl Roth	7339.1
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich	30417
Potassium chloride	Merck	49,361,000
Potters	LAT Garbsen	5 ml
SDS	Carl Roth	CN30.3
HPTLC silica gel 60	Merck	105553
Vacufuge plus basic device	Eppendorf	22820001
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom	Sigma	CLS3548
Coverslip	Thermo Fisher Scientific	1198882
Glass slide	Carl Roth	1879
BD Tuberculin Syringe Only 1 ml	BD Bioscience	309659