שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד
Summary
ליפידים ידועים לשחק תפקיד חשוב פונקציות הסלולר. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לקבוע את הרכב השומנים של נויטרופילים, עם דגש על רמת הכולסטרול, על ידי שימוש בשני HPTLC ו HPLC כדי להשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים של היווצרות מלכודת תאי נויטרופילים.
Abstract
ניתוח ליפידים בביצוע כרומטוגרפיה בשכבה דקה ביצועים גבוהים (HPTLC) הוא שיטה פשוטה יחסית, חסכונית לנתח מגוון רחב של שומנים. הפונקציה של ליפידים (למשל, באינטראקציות מארח הפתוגן או כניסה מארחת) דווחה לשחק תפקיד מכריע בתהליכים תאיים. הנה, אנחנו מראים שיטה לקביעת רכב שומנים, עם דגש על רמת הכולסטרול של נויטרופילים בדם נגזרות עיקריים, על ידי HPTLC בהשוואת כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC). המטרה הייתה לבדוק את תפקידו של שינויי שומנים / כולסטרול היווצרות מלכודות תאי נויטרופילים (נטס). שחרור NET ידוע כמנגנון הגנה מארחת כדי למנוע פתוגנים מלהתפשט בתוך הפונדקאי. לכן, נויטרופילים אדם נגזר דם טופלו מהתיל-β-cyclodextrin (MβCD) כדי לגרום שינויי שומנים בתאים. שימוש HPTLC ו HPLC, אנחנו הראינו שטיפול MβCD של תאי מוביל שומניםשינויים קשורים לירידה משמעותית תוכן הכולסטרול של התא. במקביל, טיפול MβCD של נויטרופילים הוביל להיווצרות של הנטס, כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. לסיכום, כאן אנו מציגים שיטה מפורטת ללמוד שינויי שומנים ב נויטרופילים ויצירת רשתות.
Introduction
ליפידים הוכחו ממלאים תפקידים חשובים הומאוסטזיס תא, מוות של תאים, אינטראקציות מארח הפתוגן, ציטוקינים שחרור 1. במשך הזמן, עניין וידע על ההשפעה של שומנים אינטראקציות מארח הפתוגן או דלקת גדלו, וכמה פרסומים לאשר את התפקיד המרכזי של שומנים מסוימים, ובמיוחד כולסטרול סטרואידים, בתגובות הסלולר. טיפול תרופתי בסטטינים, אשר משמשים מעכבי ביוסינתזה כולסטרול על ידי חסימת 3-הידרוקסי-3-methylglutaryl-coenzym-A-רדוקטאז (HMG-CoA-reductase), יכול לשמש סוכני אנטי דלקתיות כמו על ידי הורדת רמות בסרום של אינטרלוקין 6 ו 2 חלבון תגובתי C-. ניתן להשתמש Cholesterol- ומבנים מועשר glycosphingolipid ידי כמה פתוגנים, כגון חיידקים ווירוסים, כשער אל המארח 3, 4, 5,class = "Xref"> 6. ספינגוליפיד (למשל, ספינגומיילין) הוכח להיות בשימוש על ידי פתוגנים לקדם פתוגניות שלהם 7. מקרופאגים, השימוש mycobacteria כולסטרול מועשר תחומים להזנת התאים; דלדול של כולסטרול מעכב ספיגת mycobacterial 8. יתר על כן, זיהום של מקרופאגים עם Francisella tularensis, סוכן zoonotic אחראי טולרמיה (הידוע גם בשם קדחת ארנב) 9, הוביל לזיהום כי בוטלה כאשר הכולסטרול הידלדלה מחמת ממברנות 10. באופן דומה, הפלישה של תאים לארח על ידי coli Escherichia באמצעות מבני שומנים עשירים הודגמה להיות כולסטרול תלוי 4. יתר על כן, ניסויי זיהום סלמונלה typhimurium של תאי האפיתל הוכיחו כי הכולסטרול הוא חיוני עבור כניסת הפתוגן לתוך התאים 11. כולסטרול דלדול inhibiteד הספיגה סלמונלה 11. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה על ידי אל Gilk et. כולסטרול הוכיח כי ממלא תפקיד חשוב ב ספיגת Coxiella burnetti 12. בנוסף, Tuong ואח. נמצא כי-hydroxycholesterol 25 משחקת תפקיד מכריע phagocytosis ידי lipopolysaccharide (LPS) -stimulated מקרופאגים 13. Phagocytosis הופחתה כאשר מקרופאגים טופלו פרמקולוגית כדי לרוקן כולסטרול 14. לפיכך, כולסטרול ושומנים אחרים נראו לשחק תפקיד חשוב זיהום ודלקת, מאז הדלדול שלהם יכול להפחית את הסיכון של פלישה מכמה פתוגנים 10, 11, 12.
לאחרונה, הצלחנו להראות כי שינויי שומנים, ובעיקר הדלדול של כולסטרול מן התא, לגרום להיווצרות extracellula נויטרופיליםמלכודות r (נטס) ב נויטרופילים בדם הנגזרות אנושי 15. מאז גילוי נטס ב 2004, הם הוכחו תפקיד קריטי מלכוד חיידקי, ובכך להוות מכשול התפשטות הזיהום 16, 17. רשתות מורכבות של עמוד השדרה DNA הקשורים היסטונים, פרוטאזות, ופפטידים מיקרוביאלית 16. המהדורה של הנטס על ידי נויטרופילים יכול להיגרם על ידי הפולשים פתוגנים 18, 19 ו חומרים כימיים כגון phorbol-myristate-אצטט (PMA) או סטטינים 16, 20. עם זאת, המנגנונים הסלולר המפורטים, ובמיוחד התפקיד של שומנים בתהליך הזה, הם עדיין לא ברורים לחלוטין. הניתוח של שומנים יכול להוביל להבנה טובה יותר של המנגנונים העוסקים במגוון רחב של תהליכים תאיים ואינטראקציות, כגון שחרור נטס. Cholesteרול ו ספינגומיילין הם מרכיבים חיוניים של microdomains קרום התא השומנים, שם הם מוסיפים יציבות להקל על התקבצות של חלבונים המעורבים בסחר חלבון איתות אירועים 21. בכדי לחקור את תפקיד מכניסטית של שומנים מסוימים, סוכנים תרופתי amphiphilic, כגון מתיל-β-cyclodextrin oligosaccharide מחזורית (MβCD), שניתן להשתמש בהם כדי לשנות את הרכב השומנים של התא כדי להפחית כולסטרול במבחנה 15. כאן, אנו מציגים שיטה להשתמש HPTLC לנתח את הרכב השומנים של נויטרופילים בתגובה MβCD. HPLC שימש כדי לאשר את רמת הכולסטרול באוכלוסיה נויטרופילים. יתר על כן, אנו מתארים שיטה לחזות ההיווצרות של הנטס על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence ב נויטרופילים בדם נגזרות אנושיים בתגובת MβCD.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות שתוארו כאן ניתן להשתמש כדי לנתח שומנים ספציפיים, כגון כולסטרול, על ידי HPTLC או HPLC ו לחקור את ההשפעות של שינויי שומנים תרופתיים על ההיווצרות של הנטס (ראה נוימן ואח '. 15).
HPTLC היא שיטה יחסית חסכונית ופשוטה לנת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של Akademie für Tiergesundheit (AFT) וכן מענק של התוכנית PhD, "Animal ו מידבקות מחיות לאדם דלקות," של האוניברסיטה לרפואה וטרינרית, הנובר, גרמניה, הניתן אריאן נוימן.
Materials
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright, ., J, S. N., Abraham, The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. . Dermatology 2-Volume Set. , (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori’s cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity – A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses?. Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
