Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek
Summary
Lipidler hücresel fonksiyonlarda önemli rol oynadıkları bilinmektedir. Burada, nötrofil hücre dışı tuzak oluşumunun altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması için HPTLC ve HPLC birlikte kullanarak, kolesterol seviyesi üzerinde durularak, nötrofillerin lipit bileşimini belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC) tarafından gerçekleştirilen Lipit analizi lipid geniş bir analiz nispeten basit ve maliyet-etkin bir yöntemdir. (Evsahibi-patojen etkileşimlerinin ya da konakçı girişinde, örneğin) lipidlerin fonksiyonu hücresel süreçlerde önemli bir rol oynadığı bildirilmiştir. Burada, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile karşılaştırıldığında HPTLC ile birincil kan türevi nötrofil kolesterol seviyesi, odaklanarak, lipid bileşimin belirlenmesi için bir yöntem göstermektedir. Amaç nötrofil hücre dışı tuzakları (NET) oluşumunda lipit / kolesterol değişikliklerin rolünün araştırılması amaçlanmıştır. NET salma konakçı içinde yayılmasını patojenlerin önlenmesinde bir konakçı savunma mekanizması olarak da bilinir. Bu nedenle, kan-türevi insan nötrofil hücrelerde lipid değişiklikleri indükleme metil-β-siklodekstrin (MβCD) ile muamele edildi. HPTLC ve HPLC kullanarak, hücrelerin MβCD tedavi lipid yol açtığını göstermiştirHücrenin kolesterol içeriğinde önemli bir azalma ile ilişkili değişiklikler. mikroskobik inceleme ile gösterildiği gibi aynı zamanda, nötrofillerin MβCD tedavisi, NET'ler oluşumuna yol açtı. Özetle, burada lipit nötrofillerin de değiştirmiş ve NET'ler oluşumunu incelemek için detaylı bir yöntem mevcut.
Introduction
Lipidler, hücre homeostazı, hücre ölümü, konukçu-patojen etkileşimlerine ve sitokin salınımı 1 'de önemli roller oynadığı gösterilmiştir. Zamanla,-konak ilişkilerinin veya inflamasyon lipitlerin etkisi hakkında faiz ve bilgi artmıştır ve çeşitli yayınlar hücresel yanıtlarda bazı lipidlerin merkezi bir rol, özellikle steroid kolesterol, teyit etmektedir. 3-hidroksi-3-metilglutaril-koenzim A-redüktaz engelleyerek kolesterol biyosentezi inhibitörleri olarak kullanılan statinlerin, farmakolojik tedavi (HMG-CoA-redüktaz), interlökin serum seviyelerinin düşürülmesi ile olduğu gibi, anti-inflamatuar ajanlar olarak hareket edebilmeleri 6 ve C-reaktif protein 2. Kolesterin ve glikosfingolipid zenginleştirilmiş yapıları, ev sahibi 3, 4, 5 içine bir geçit olarak, bakteri ve virüs gibi çeşitli patojenleri tarafından kullanılabilirclass = "xref"> 6. (Örneğin, sfingomiyelin) gösterilmiştir sfingolipitler kendi patojenik 7 desteklemek için patojenler tarafından kullanılır. makrofajlar olarak, mikobakteri kullanımı hücrelerine girmesi için etki kolesterol ile zenginleştirilmiş; kolesterol tükenmesi mikobakteri alımını 8 engeller. Bundan başka, Francisella tularensis, (tavşan ateş olarak da bilinir) tularemi sorumlu zoonotik madde 9, makrofajların enfeksiyon kolesterol membranları 10 tükendiği zaman kaldırılmış bir enfeksiyon yol açtı. Benzer bir şekilde, lipid bakımından zengin yapılar ile Escherichia coli konakçı hücrelerin istilası kolesterol bağımlı 4 olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, epitel hücrelerinin, Salmonella typhimurium enfeksiyon deneyleri kolesterol hücreleri 11 içine patojen giriş için gerekli olduğunu göstermiştir. Kolesterol tükenmesi inhibitör yönde etkiSalmonella 11 d alımı. Ayrıca, Gilk ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışma. Kolesterol Coxiella burnetti 12 alımında önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Buna ek olarak, Tuong ve diğ. 25-hidroksikolesterol lipopolisakarit (LPS) tarafından fagositosis çok önemli bir rol oynadığı bulunmuştur makrofajlar 13 ile uyarılmış. Makrofajlar farmakolojik olarak kolesterol 14 tüketmek için tedavi edildi fagositoz düşürülmüştür. Böylece, kolesterol ve diğer lipidler kendi tükenmesi birçok patojenler 10, 11, 12 ila istilası riskini azaltabilir, çünkü enfeksiyon ve enflamasyon önemli bir rol oynamaktadır.
Son zamanlarda, nötrofil extracellula oluşumunu, yani lipid değişiklikleri, hücreden kolesterol özellikle tüketilmesi göstermektedir uyarabilirİnsan kan türevi nötrofil 15 r trans (NET). 2004 yılında NET'ler keşfinden beri, bunlar bakteri tuzak kritik roller oynadığı gösterilmiştir ve bu nedenle enfeksiyon 16, 17 yayılmasını engelleyen içinde edilmiştir. NET'ler histonlar, proteazlar ve antimikrobiyal peptitler 16 ile bağlantılı bir DNA omurgasından oluşur. Nötrofiller tarafından NET'ler salım, forbol-miristat-asetat (PMA) veya 16 statinler, 20 patojenleri 18, 19 ve kimyasal madde işgal tarafından indüklenebilir. Bununla birlikte, detaylı hücresel mekanizmalar, ve bu işlem lipidlerin özellikle rolü, yine de, tamamen açık değildir. lipidlerin analizi bu tür NET'ler sürümü olarak hücresel süreçleri ve etkileşimleri, çeşitli karışan mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına yol açabilir. Cholesterol ve sfingomiyelin ve istikrar ekleyin ve protein göçünü ve olayları 21 sinyal yer alan proteinlerin kümelenme kolaylaştırmak hücre zarı ve lipit mikro bölgeleri, hayati bir bileşenidir. Bu tür siklik oligosakarit metil-β-siklodekstrin (MβCD) gibi bazı lipid, amfifilik farmakolojik maddeler, mekanistik rolünü araştırmak için, bir hücrenin lipit bileşimini değiştirmek için ve in vitro 15 kolesterolü düşürmek için kullanılabilir. Burada, MβCD yanıt olarak nötrofillerin lipid bileşiminin analiz edilmesi için HPTLC kullanmak için bir yöntem sunulmaktadır. HPLC nötrofil popülasyonunda kolesterol seviyesini onaylamak için kullanılmıştır. Ayrıca, MβCD yanıt olarak insan kan türevi nötrofillerde mikroskobi ile NET'ler oluşumunu görselleştirmek için bir yöntem tarif eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen yöntemler, HPTLC veya HPLC ile kolesterol gibi belirli lipidler, analiz etmek ve NET'ler oluşumu farmakolojik lipit değişikliklerin etkisini incelemek için kullanılabilir (Neumann ve ark., 15).
HPTLC örneklerin çok sayıda lipid geniş bir analiz etmek için nispeten düşük maliyetli ve basit bir yöntemdir. Bu yöntem, antibiyotik miktarının 25, lizozomal depo hastalıkları 26</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ariane Neumann sağlanan Veterinerlik, Hannover, Almanya Üniversitesi, "Hayvan ve Zoonotik Enfeksiyonlar" Akademie für Tiergesundheit (AFT) ve doktora programı, bir burs bir burs ile desteklenmiştir.
Materials
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright, ., J, S. N., Abraham, The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. . Dermatology 2-Volume Set. , (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori’s cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity – A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses?. Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
