Metoder för att studera Lipidförändringarna i neutrofiler och efterföljande bildning av neutrofila Extracellulär Fällor
Summary
Lipider är kända för att spela en viktig roll i cellfunktioner. Här beskriver vi en metod för att bestämma lipidkompositionen av neutrofiler, med betoning på kolesterolnivån, genom att använda både HPTLC och HPLC för att få en bättre förståelse för de underliggande mekanismerna för neutrofil extracellulär fälla bildning.
Abstract
Lipidanalys utförs genom högupplösande tunnskiktskromatografi (HPTLC) är en relativt enkel, kostnadseffektiv metod för att analysera ett brett spektrum av lipider. Funktionen av lipider (t ex i värd-patogen interaktioner eller värd post) har rapporterats spela en avgörande roll i cellulära processer. Här visar vi en metod för att bestämma lipidkomposition, med fokus på kolesterolnivån av primära blodhärledda neutrofiler, med HPTLC i jämförelse med högeffektiv vätskekromatografi (HPLC). Syftet var att undersöka rollen av lipid / kolesterol förändringar i bildningen av neutrofila extracellulära fällor (NET). NET frisättning är känd som en värdens försvar mekanism för att förhindra patogener från att sprida sig i värden. Därför togs blodhärledda humana neutrofiler behandlade med metyl-β-cyklodextrin (MβCD) för att inducera lipid förändringar i cellerna. Med användning av HPTLC och HPLC, har vi visat att MβCD behandling av cellerna leder till lipidändringar i samband med en betydande minskning av innehållet i cellen kolesterol. På samma gång, MβCD behandling av neutrofilerna ledde till bildandet av NET, såsom visas genom immunofluorescens-mikroskopi. Sammanfattningsvis, Här presenterar vi en detaljerad metod för att studera fett förändringar i neutrofiler och bildandet av nät.
Introduction
Lipider har visat sig spela en viktig roll i cell homeostas, celldöd, värd-patogen interaktioner och cytokinfrisättning 1. Med tiden har intresset för och kunskapen om effekterna av lipider i värd patogen interaktioner eller inflammation ökat och flera publikationer bekräftar den centrala roll som vissa lipider, särskilt steroid kolesterol, i cellulära svar. Farmakologisk behandling med statiner, vilka används som inhibitorer av kolesterolbiosyntes genom att blockera 3-hydroxi-3-metylglutaryl-coenzym-A-reduktas (HMG-CoA-reduktas), kan fungera som anti-inflammatoriska medel genom att sänka serumnivåerna av interleukin 6 och C-reaktivt protein 2. Kolesterol- och glykosfingolipid-berikade strukturer kan användas av flera patogener, såsom bakterier och virus, som en gateway i värden 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Sfingolipider (t.ex. sfingomyelin) har visat sig kunna användas av patogener för att främja deras patogenicitet 7. I makrofager, mykobakterier användning kolesterolanrikad domäner för tränga in i cellerna; en utarmning av kolesterol hämmar mykobakteriell upptag 8. Vidare infektion av makrofager med Francisella tularensis, en zoonotisk medel som är ansvarigt för tularemi (även känd som kanin feber) 9, ledde till en infektion som avskaffades när kolesterol utarmades från membranen 10. På liknande sätt, var invasionen av värdceller av Escherichia coli via lipidrika strukturer visat sig vara kolesterolberoende 4. Dessutom, Salmonella typhimurium infektionsexperiment av epitelceller visade att kolesterol är väsentliga för patogen inträde in i cellerna 11. Kolesterol utarmning inhibited upptaget av Salmonella 11. Dessutom, en nyligen genomförd studie av Gilk et al. visade att kolesterol spelar en viktig roll i upptaget av Coxiella burnetti 12. Dessutom, Tuong et al. fann att 25-hydroxikolesterol spelar en avgörande roll i fagocytos av lipopolysackarid (LPS) -stimulerade makrofager 13. Fagocytos reducerades när makrofager farmakologiskt behandlas för att utarma kolesterol 14. Således, kolesterol och andra lipider verkar spela en viktig roll vid infektion och inflammation, eftersom deras utarmning kan minska risken för invasion från flera patogener 10, 11, 12.
Nyligen kunde vi visa att Lipidförändringarna, särskilt utarmning av kolesterol från cellen, framkalla bildandet av neutrofila extracellular fällor (NET) i humana blodhärledda neutrofiler 15. Sedan upptäckten av NET 2004, har de visat sig spela viktiga roller i bakterie entrapment, och därmed hindra smittspridning 16, 17. NET består av en DNA-huvudkedja associerad med histoner, proteaser och antimikrobiella peptider 16. Frisättningen av de nät av neutrofiler kan induceras av invaderande patogener 18, 19 och kemiska substanser såsom forbol-myristat-acetat (PMA) eller statiner 16, 20. Men de detaljerade cellulära mekanismer och i synnerhet rollen av lipider i denna process är ännu inte helt klart. Analysen av lipider kan leda till en bättre förståelse av de mekanismer som är involverade i en mängd olika cellulära processer och interaktioner, såsom frisättning av NET. Cholesterol och sfingomyelin är viktiga beståndsdelar i cellmembranet och lipida mikrodomäner, där de tillför stabilitet och underlättar klustring av de proteiner som är involverade i protein trafficking och signaleringshändelser 21. För att undersöka den mekanistiska rollen av vissa lipider, amfifila farmakologiska medel, såsom den cykliska oligosackarid metyl-β-cyklodextrin (MβCD), kan användas för att förändra lipidkompositionen av en cell och för att minska kolesterol in vitro 15. Här presenterar vi en metod för att använda HPTLC att analysera lipidkompositionen av neutrofiler som svar på MβCD. HPLC användes för att bekräfta nivån av kolesterol i neutrofila populationen. Vidare beskriver vi en metod för att visualisera bildningen av NET genom immunofluorescens-mikroskopi i humana blodhärledda neutrofiler som svar på MβCD.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder som beskrivs här kan användas för att analysera specifika lipider, såsom kolesterol, genom HPTLC eller HPLC och för att undersöka effekterna av farmakologiska Lipidförändringarna på bildandet av NET (se et al. Neumann 15).
HPTLC är en relativt kostnadseffektiv och enkel metod för att analysera ett brett spektrum av lipider i ett stort antal prover. Denna metod har använts i många forskningsområden, inklusive antibiotikum kvantifiering…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett stipendium på Akademie für Tiergesundheit (Aid for Trade) och ett stipendium från forskarutbildningen, "Animal och zoonotiska infektioner" vid University of Veterinary Medicine, Hannover, Tyskland, under förutsättning att Ariane Neumann.
Materials
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright, ., J, S. N., Abraham, The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. . Dermatology 2-Volume Set. , (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori’s cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity – A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses?. Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
