Мышь Изолированные перфузировались почки Техника
Summary
Мышь , изолированных перфузию почек (МИПК) представляет собой метод для поддержания почки мыши в условиях бывших естественных условиях перфузии и функциональных в течение 1 часа. Буферы и хирургическая техника подробно описаны.
Abstract
Мышь , изолированных перфузию почек (МИПК) представляет собой метод для поддержания почки мыши в условиях бывших естественных условиях перфузии и функциональных в течение 1 часа. Это является предпосылкой для изучения физиологии изолированного органа, а также для многих инновационных приложений, которые могут быть возможно в будущем, в том числе перфузионной decellularization для почек биоинженерии или введения анти-отторжения или генома редактирования препаратов в высоких дозах премьер почки для трансплантации. Во время перфузии почек можно манипулировать, функция почек может быть оценена, и различные фармацевтические препараты вводят. После процедуры, почки могут быть пересажены или обработаны для молекулярной биологии, биохимического анализа, или микроскопии.
В данной статье описывается перфузат и хирургической техники , необходимой для экс естественных условиях перфузии почек мыши. Подробная информация о перфузионного устройства приведены данные, показывающие клиновойiability подготовки Почки в: почечный кровоток, сосудистое сопротивление, и мочи данных как функциональных, просвечивающей электронной микрофотографии различных сегментов нефрона как морфологическими считываниями и вестерн-блоттинга транспортных белков различных сегментов нефрона как молекулярного считывания.
Introduction
Изолированная перфузия органов была предметом постоянных усилий между физиологи в течение многих десятилетий 1. Методика позволяет функцию органа, без системных воздействий, таких как кровяное давление, гормоны, или нервов, чтобы быть изучены. Карл Эдуард Loebell считается первым описал успешное перфузия изолированной почки, в 1849 году 2. С тех пор перфузия аппарат претерпел значительные доработки. Фрей и Грубер представил искусственное легкое для оксигенации и пульсирующих насосов для непрерывной перфузии 2. В то время как ранние исследователи изучали в основном почки крупных млекопитающих, а именно, свиней и собак 2 3 -Первый отчет об использовании почек крыс, Вейсса и др. , Стала важной вехой в изучении перфузии небольшого млекопитающего-органа 4. Schurek и др. сообщили о необходимости добавления к эритроцитам млекопитающих перфузату при наличии достаточных почечных канальцевоксигенации было быть достигнуто 5. Критические для долгосрочных экспериментов было введение непрерывного диализа буфера с помощью той же исследовательской группой 6. В 2003 году Schweda и др. были первыми , чтобы сообщить о функциональной мыши изолированных перфузии почек (МИПК) 7, позже уточнена Rahgozar и др. 18 и Lindell и др. 14.
В то время как технически более сложной, чем крысы, изолированных перфузии почек, использование МИПК имеет то преимущество, что позволяет использовать широкий спектр генетически измененных мышей. В данной статье представлены подробности метода авторов для перфузии изолированных почек мыши в течение 1 часа. Метод позволяет для непрерывной оценки скорости почечного кровотока, сосудистого сопротивления, высвобождение гормонов, анализ газового состава крови, анализ мочи, а также применение лекарственных средств. После процедуры, почки могут быть обработаны для молекулярного и биохимического анализа, должны быть установлены для микроскопии, илипересаживают в мышь – реципиента (рис 1).
Рисунок 1: Обзор возможных ввода / вывода к изолированному перфузировались почки. BGA: анализ газов крови. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Этот метод , вероятно , будет получать все большее внимание в предстоящие годы, так как многие инновационные приложения обсуждаются с рассветом длительной нормотермической перфузии почек до трансплантации (с или без применения анти-отторжения или генома редактирования наркотиков) 8, 9, 10 , 11, биоинженерии целых почек от decellularized каркасах 12, и применение высоких доз флуоресцентных красителей для многофотонной томографии 13 </sup>. Он также является идеальной моделью , с которой для изучения роли специфических генов во время острого повреждения почек 14.
Протокол шаг за шагом дается, чтобы другие лаборатории проводить изолированную мыши почки перфузию успешно. Во-первых, состав и приготовление буфера задается. Затем, операция подробно описана и показаны критические шаги. В-третьих, данные представлены, которые являются репрезентативными для успешной подготовки: почечного кровотока, сосудистого сопротивления, скорости клубочковой фильтрации, а дробная электролит экскреции-все, как функциональные измерения жизнеспособности-и просвечивающей электронной микроскопии морфологии различных сегментов нефрона перфузией почек фиксированной после 1 часа перфузии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мышь , изолированных перфузию почек является инструментом для изучения функции почек в контролируемой среде экс естественных условиях в течение 1 ч, преодоление разрыва между экспериментами в естественных условиях у интактных животных, которые могут быть испорчено под возд?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Michèle Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and Jürg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research “Kidney.CH” and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.
Materials
| Perfusion Circuit: | |||
| Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 1L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 0.5L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE-Tubing for aorta cannulation 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer reagents: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
| Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Analysis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Electron Microscope: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
References
- Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).
- Skutul, K. . Über Durchströmungsapparate Pflüger’s Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).
- Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).
- Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).
- Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).
- Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).
- Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).
- Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).
- Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).
- Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).
- Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19 (5), 646-651 (2013).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
- Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).
- Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger’s Archiv. , (2016).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).
