La tecnica del rene perfusi mouse isolato
Summary
L'isolato rene perfuso mouse (MIPK) è una tecnica per mantenere un rene mouse sotto ex vivo condizioni perfusi e funzionali per 1 ora. I buffer e tecnica chirurgica sono descritte in dettaglio.
Abstract
L'isolato rene perfuso mouse (MIPK) è una tecnica per mantenere un rene mouse sotto ex vivo condizioni perfusi e funzionali per 1 ora. Questo è un prerequisito per lo studio della fisiologia dell'organo isolata e per molte applicazioni innovative che possono essere possibile in futuro, tra perfusione decellularization per la bioingegneria reni o la somministrazione di anti-rigetto o droghe genoma-editing in dosi elevate per innescare il rene per il trapianto. Durante il tempo della perfusione, il rene può essere manipolato, funzione renale può essere valutata, e vari farmaci somministrati. Dopo la procedura, il rene può essere trapiantato o trasformati per la biologia molecolare, l'analisi biochimica, o al microscopio.
Questo articolo descrive il perfusato e la tecnica chirurgica necessaria per la perfusione ex vivo di reni mouse. Dettagli dell'apparato perfusione sono date e dati sono presentati mostra la vESPONSABILITÀ di preparazione del rene: il flusso ematico renale, la resistenza vascolare, e delle urine dati come, microscopio elettronico di trasmissione funzionali dei diversi segmenti del nefrone come letture morfologiche, e le macchie occidentali di proteine di trasporto dei diversi segmenti del nefrone come lettura molecolare.
Introduction
La perfusione isolata di organi è stato oggetto di uno sforzo continuo tra fisiologi per molti decenni 1. La tecnica consente la funzione dell'organo, senza influenze sistemiche come la pressione sanguigna, ormoni, o nervi, da studiare. Carl Eduard Loebell è considerato il primo ad aver descritto la perfusione successo di un rene isolato, nel 1849 2. Da allora, l'apparato perfusione ha subito notevole raffinatezza. Frey e Gruber ha introdotto un polmone artificiale per le pompe di ossigenazione e pulsatile per continua perfusione 2. Mentre i primi ricercatori hanno studiato principalmente i reni di grandi mammiferi, cioè, maiali e cani 2 3 -la prima relazione l'uso di reni di ratto, di Weiss et al. , È stata una pietra miliare nello studio della perfusione piccolo-mammifero-organo 4. Schurek et al. riferito la necessità di aggiungere eritrociti di mammifero al perfusato se tubulare renale sufficienteossigenazione doveva essere raggiunto 5. Critico per esperimenti di lunga durata è stata l'introduzione della dialisi continua del buffer dallo stesso gruppo di ricerca 6. Nel 2003, Schweda et al. sono stati i primi a segnalare un rene del mouse funzionale isolato perfuso (MIPK) 7, in seguito perfezionato da Rahgozar et al. 18 e Lindell et al. 14.
Mentre tecnicamente più impegnativo rispetto al ratto isolato rene perfuso, l'uso del MIPK porta il vantaggio di permettere l'uso di una vasta gamma di topi geneticamente modificati. Questo documento presenta i dettagli del metodo degli autori per la perfusione isolata reni del mouse per 1 ora. Il metodo consente la valutazione continua della velocità di flusso renale, resistenza vascolare, rilascio di ormone, emogasanalisi, analisi delle urine, e l'applicazione di farmaci. Seguendo la procedura, reni potrebbero essere trattati per analisi molecolari e biochimiche, fissati per la microscopia, otrapiantato in un topo ricevente (Figura 1).
Figura 1: panoramica dei possibili Input / Output al rene isolato e perfuso. BGA: analisi dei gas del sangue. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Questa tecnica probabile che riceverà maggiore attenzione nei prossimi anni, come molte applicazioni innovative sono in discussione con l'alba di una prolungata perfusione del rene normotermico prima del trapianto (con o senza l'applicazione di anti-rigetto o droghe genoma-editing) 8, 9, 10 , 11, la bioingegneria di interi reni da impalcature decellularized 12, e l'applicazione di elevate dosi di coloranti fluorescenti per l'imaging multiphoton 13 </sup>. E 'anche un modello ideale con cui studiare il ruolo di specifici geni durante il danno renale acuto 14.
Un protocollo step-by-step è dato per consentire ad altri laboratori di eseguire isolato mouse perfusione del rene con successo. Innanzitutto, è specificato la composizione e preparazione del buffer. Quindi, l'intervento è descritto in dettaglio e sono presenti i punti critici. In terzo luogo, i dati vengono presentati che sono rappresentativi di una preparazione di successo: il flusso ematico renale, la resistenza vascolare, velocità di filtrazione glomerulare, e degli elettroliti frazionaria misurazioni funzionali di vitalità e di elettroni trasmissione micrografie della morfologia dei diversi segmenti nefrone di reni perfusi tutti escrezione- fisso dopo 1 ora di perfusione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il mouse isolato rene perfuso è uno strumento per lo studio della funzione renale in un ambiente controllato ex-vivo per 1 ora, colmando il divario tra esperimenti in vivo su animali intatti, che può essere viziata da l'impatto di numerosi fattori sistemici, e in esperimenti in vitro in nefrone isolati o cellule in coltura, che necessariamente trascurare l'impatto della struttura dell'organo intatta sulla funzione. C'è, alla conoscenza degli autori, non tecnica alte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Michèle Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and Jürg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research “Kidney.CH” and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.
Materials
| Perfusion Circuit: | |||
| Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 1L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 0.5L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE-Tubing for aorta cannulation 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer reagents: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
| Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Analysis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Electron Microscope: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
References
- Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).
- Skutul, K. . Über Durchströmungsapparate Pflüger’s Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).
- Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).
- Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).
- Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).
- Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).
- Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).
- Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).
- Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).
- Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).
- Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19 (5), 646-651 (2013).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
- Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).
- Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger’s Archiv. , (2016).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).
