माउस पृथक perfused किडनी तकनीक
Summary
माउस पृथक perfused गुर्दा (MIPK) पूर्व vivo की स्थिति भरकर रखा और 1 घंटे के लिए कार्यात्मक के तहत एक माउस गुर्दे रखने के लिए एक तकनीक है। buffers और सर्जिकल तकनीक में विस्तार से बताया गया है।
Abstract
माउस पृथक perfused गुर्दा (MIPK) पूर्व vivo की स्थिति भरकर रखा और 1 घंटे के लिए कार्यात्मक के तहत एक माउस गुर्दे रखने के लिए एक तकनीक है। यह अलग अंग की और कई अभिनव अनुप्रयोगों है कि भविष्य में संभव हो सकता है, या गुर्दे bioengineering के लिए छिड़काव decellularization विरोधी अस्वीकृति या प्रधानमंत्री गुर्दे के लिए उच्च खुराक में जीनोम संपादन दवाओं के प्रशासन सहित, के लिए शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन के लिए एक शर्त है प्रत्यारोपण के लिए। छिड़काव के समय के दौरान, गुर्दे, चालाकी से किया जा सकता है गुर्दे समारोह का आकलन किया जा सकता है, और विभिन्न दवाइयों दिलाई। प्रक्रिया के बाद, गुर्दा प्रत्यारोपित या आणविक जीव विज्ञान, जैव रासायनिक विश्लेषण, या माइक्रोस्कोपी के लिए कार्रवाई की जा सकती।
इस पत्र perfusate और सर्जिकल तकनीक माउस गुर्दे के पूर्व vivo छिड़काव के लिए आवश्यक का वर्णन है। छिड़काव उपकरण का विवरण दिया जाता है और डेटा वी दिखा प्रस्तुत कर रहे हैंगुर्दे की तैयारी की iability: कार्यात्मक, रूपात्मक readouts, और आणविक readout के रूप में विभिन्न क्षेत्रों के नेफ्रॉन परिवहन प्रोटीन के पश्चिमी दाग के रूप में विभिन्न क्षेत्रों के नेफ्रॉन के संचरण इलेक्ट्रॉन micrographs के रूप में गुर्दे रक्त प्रवाह, संवहनी प्रतिरोध, और मूत्र डेटा।
Introduction
अंगों के अलग छिड़काव कई दशकों के लिए 1 physiologists के बीच चल रहे एक प्रयास का विषय रहा है। तकनीक, अंग के समारोह में सक्षम बनाता है ऐसे रक्तचाप, हार्मोन, या नसों के रूप में प्रणालीगत प्रभाव के बिना, अध्ययन किया जाएगा। कार्ल Eduard Loebell पहले एक अलग गुर्दे का सफल छिड़काव का वर्णन किया है करने के लिए 1849 में 2, माना जाता है। तब से, छिड़काव उपकरण महत्वपूर्ण शोधन आया है। फ्रे और Gruber निरंतर छिड़काव 2 के लिए ऑक्सीजन और गुणवाला पंपों के लिए एक कृत्रिम फेफड़ों की शुरुआत की। जबकि जल्दी शोधकर्ताओं ने मुख्य रूप से बड़े स्तनधारियों-अर्थात्, सूअर 2 और 3 कुत्तों चूहे गुर्दे के उपयोग के -इस पहली रिपोर्ट, वेइस एट अल द्वारा के गुर्दे का अध्ययन किया। , छोटे स्तनपायी-अंग छिड़काव 4 के अध्ययन में एक मील का पत्थर था। Schurek एट अल। perfusate यदि पर्याप्त गुर्दे ट्यूबलर को स्तनधारी एरिथ्रोसाइट्स जोड़ने की आवश्यकता सूचना दीऑक्सीजन प्राप्त किया जा करने के लिए 5 था। लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण एक ही अनुसंधान समूह 6 से बफर के निरंतर डायलिसिस की शुरूआत थी। 2003 में, Schweda एट अल। पहले एक कार्यात्मक माउस पृथक perfused गुर्दा (MIPK) 7, बाद में Rahgozar एट अल द्वारा परिष्कृत रिपोर्ट करने के लिए थे। 18 और Lindell एट अल। 14।
जबकि चूहे भरकर रखा गुर्दे पृथक से तकनीकी रूप से अधिक चुनौतीपूर्ण, MIPK के उपयोग के आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों की एक विस्तृत सरणी का उपयोग को सक्षम करने का लाभ भालू। इस पत्र 1 घंटे के लिए पृथक माउस गुर्दे perfusing के लिए लेखकों को 'विधि का ब्यौरा प्रस्तुत करता है। विधि गुर्दे प्रवाह की दर, संवहनी प्रतिरोध, हार्मोन रिलीज, रक्त गैस विश्लेषण, मूत्र विश्लेषण, और दवाओं के आवेदन के सतत मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। प्रक्रिया के बाद, गुर्दे, आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए कार्रवाई की जा सकती है माइक्रोस्कोपी के लिए तय हो सकता है, या(चित्रा 1) एक प्राप्तकर्ता माउस में प्रत्यारोपित।
चित्रा 1: संभव इनपुट / आउटपुट, अलग भरकर रखा किडनी के अवलोकन। BGA: रक्त गैस विश्लेषण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
इस तकनीक की संभावना, 10 के रूप में कई नए अनुप्रयोगों के साथ (या विरोधी अस्वीकृति या जीनोम संपादन दवाओं के आवेदन के बिना) 8, 9 प्रत्यारोपण से पहले लंबे समय तक normothermic गुर्दे छिड़काव की सुबह के साथ विचार-विमर्श किया जा रहा है, आने वाले वर्षों में बढ़ती ध्यान प्राप्त होगा , 11, decellularized scaffolds 12 से पूरे गुर्दे की जैव अभियांत्रिकी और multiphoton इमेजिंग 13 के लिए फ्लोरोसेंट रंगों की उच्च खुराक के आवेदन </sup>। यह भी जिसके साथ तीव्र गुर्दे चोट 14 के दौरान विशिष्ट जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है।
एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल अन्य प्रयोगशालाओं पृथक माउस गुर्दे छिड़काव सफलतापूर्वक प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देने के लिए दिया जाता है। पहला, रचना और बफर की तैयारी निर्दिष्ट किया जाता है। फिर, सर्जरी में विस्तार से वर्णन किया गया है और महत्वपूर्ण कदम दिखाए जाते हैं। तीसरा, डेटा प्रस्तुत किया जाता है कि एक सफल तैयारी के प्रतिनिधि हैं: गुर्दे रक्त प्रवाह, संवहनी प्रतिरोध, glomerular निस्पंदन दर, और आंशिक इलेक्ट्रोलाइट उत्सर्जन सभी भरकर रखा गुर्दे के विभिन्न खंडों नेफ्रॉन की आकृति विज्ञान की व्यवहार्यता और संचरण इलेक्ट्रॉन micrographs के रूप में कार्य माप छिड़काव के 1 घंटे के बाद तय की।
Protocol
Representative Results
Discussion
माउस भरकर रखा गुर्दे पृथक 1 घंटे के लिए एक नियंत्रित वातावरण पूर्व vivo में गुर्दे समारोह के अध्ययन बरकरार पशुओं में इन विवो प्रयोगों, जो कई प्रणालीगत कारकों के प्रभाव से त्रुटिपूर्ण हो सकता है के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Michèle Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and Jürg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research “Kidney.CH” and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.
Materials
| Perfusion Circuit: | |||
| Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 1L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 0.5L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE-Tubing for aorta cannulation 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer reagents: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
| Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Analysis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Electron Microscope: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
References
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