باستخدام الحمض النووي الريبي لكشف التسلسل رواية لصق المتغيرات ذات الصلة لمقاومة المخدرات في<em> في المختبر</em> نماذج السرطان
Summary
نحن هنا وصف بروتوكول يهدف إلى التعرف على تأثير الربط الشاذة على مقاومة الأدوية في الأورام الصلبة والأورام الخبيثة الدموية. لتحقيق هذا الهدف، قمنا بتحليل الشخصية transcriptomic نماذج الوالدين والمقاومة في المختبر من خلال الحمض النووي الريبي يليها، وأنشأ طريقة تقوم QRT-PCR للتحقق من صحة الجينات المرشحة.
Abstract
تبقى مقاومة المخدرات مشكلة رئيسية في علاج السرطان لكلا الأورام الخبيثة الدموية والأورام الصلبة. يمكن أن يكون سبب المقاومة الذاتية أو التي حصل عليها مجموعة من الآليات، بما في ذلك زيادة القضاء على المخدرات، وانخفاض امتصاص الدواء، تعطيل المخدرات والتعديلات أهداف المخدرات. وأظهرت بيانات حديثة أن بخلاف المعروفة الجيني (الطفرة، والتضخيم) وجينية (hypermethylation الحمض النووي، هيستون في مرحلة ما بعد متعدية التعديل) التعديلات، وآليات المقاومة للعقاقير ويمكن أيضا أن ينظم الانحرافات الربط. هذا هو المجال المتنامي بسرعة التحقيق التي تستحق الاهتمام في المستقبل من أجل تخطيط مناهج علاجية أكثر فعالية. ويهدف البروتوكول وصفها في هذه الورقة إلى التعرف على تأثير الربط الشاذة على مقاومة الأدوية في الأورام الصلبة والأورام الخبيثة الدموية. لتحقيق هذا الهدف، قمنا بتحليل الشخصية transcriptomic من عدة نماذج في المختبر من خلال الحمض النووي الريبي يليها وإقامةإد QRT-PCR الأسلوب القائم على التحقق من صحة الجينات المرشحة. على وجه الخصوص، قمنا بتقييم الربط التفاضلية من DDX5 وPKM النصوص. تم التحقق من صحة الربط الشاذة الكشف عنها بواسطة أداة الحسابية الحصير في خلايا اللوكيميا، وتبين أن يتم التعبير عن مختلف المتغيرات DDX5 لصق في الخلايا المقاومة مقابل الدية. في هذه الخلايا، ونحن أيضا لاحظ أعلى PKM2 / نسبة PKM1، الذي لم يتم الكشف في Panc-1 نظيره مقاومة للجيمسيتابين مقارنة الأبوية خلايا Panc-1، مما يشير إلى آلية مختلفة من المخدرات المقاومة الناجمة عن التعرض جيمسيتابين.
Introduction
وعلى الرغم من التقدم الكبير في علاج السرطان، ومقاومة للخلايا الخبيثة للعلاج الكيميائي، إما ذاتية أو مكتسبة عند التعرض المخدرات لفترات طويلة، هو السبب الرئيسي لفشل العلاج في مجموعة واسعة من سرطان الدم والأورام الصلبة 1.
من أجل ترسيم الآليات الكامنة وراء مقاومة الجراثيم للأدوية، في نماذج خط الخلية في المختبر يتم تطويرها من قبل مجموعة متدرجة من الخلايا السرطانية مقاومة للعوامل العلاج الكيميائي. هذا الإجراء يحاكي الأنظمة المستخدمة في المرافق الصحية، وبالتالي يسمح في عمق التحقيق في آليات مقاومة ذات الصلة. الخلايا المقاومة التي تنجو من العلاج ثم يتم تمييزها عن الخلايا الحساسة الوالدين باستخدام المقايسات بقاء الخلية / السمية الخلوية 2. في التشكيلات المقاومة للأدوية في المختبر من خلايا أولية وقد ثبت أن تكون مرتبطة إلى حد كبير في استجابة سريرية للعلاج الكيميائي 3.
الإنتاجية العالية cytotoتشكل المقايسات xicity طريقة ملائمة لتحديد حساسية المخدرات في المختبر. هنا، يتم تقييم الجدوى من الخلايا على سبيل المثال 3- [4،5-dimethylthiazol-2-YL] -2،5-ثنائي بروميد نتروبلو – الإنتقالي العسكري فحص 4، والتي تقوم على تحويل التمثيل الغذائي لبعض ركائز (أي، أملاح نتروبلو) إلى منتجات الملونة، مما يعكس النشاط الميتوكوندريا من الخلايا. بدلا من ذلك، ومحتوى البروتين من الخلايا يمكن أن يكون كميا باستخدام فحص sulforhodamine ب (SRB) 5. هنا، وعدد من خلايا قابلة للحياة يتناسب مع الكثافة الضوئية (OD) قياس في الطول الموجي المناسب في معمل، ولا حاجة ل واسعة النطاق وإجراءات عد الخلايا تستغرق وقتا طويلا. ويمكن حساب تثبيط نمو الناجمة عن معينة المخدرات العلاج الكيميائي على أساس OD من الآبار التي تم علاج الخلايا مع وكيل اختبار ومقارنة مع OD من الخلايا السيطرة غير المعالجة. منحنى الاستجابة للجرعة هو obtaINED بالتآمر تركيز الدواء مقابل نسبة من خلايا قابلة للحياة النسبية للسيطرة على الخلايا. وأخيرا، يمكن الإبلاغ عن حساسية العقاقير مثل التركيز الذي يؤدي إلى 50٪ من تثبيط نمو الخلايا بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة (IC 50).
وتشمل الآليات الكامنة وراء مقاومة الجراثيم للأدوية العديد من تشوهات مختلفة، مثل التغيرات التي تؤثر على التعبير الجيني من محددات النشاط المخدرات والأيض الخلوي. هذه الآفات الجزيئية، بما في ذلك الطفرات، وانحرافات في النسخي ومرحلة ما بعد النسخي وكذلك تنظيم جينية منزعجة كثيرا ما تؤثر على الجينات المسؤولة سواء في استقلاب الدواء أو موت الخلايا المبرمج 6.
وقد تلقى البديل قبل الربط مرنا وتنظيمه معقدة في الآونة الأخيرة اهتماما كبيرا ككيان الرواية التي قد تملي مقاومة المخدرات من الخلايا السرطانية 7. ما يصل الى 95٪ من الجينات البشرية وتقسم بدلا من ذلك في الخلايا الطبيعية عن طريق هذابإحكام عملية التنظيم التي تنتج العديد من الأشكال الإسوية بروتين مختلفة من نفس الجين. وغالبا ما حررت الربط البديلة في السرطان وتتميز العديد من الأورام عن طريق الربط غيرت من عدد متزايد من الجينات المسؤولة عن استقلاب الدواء (أي كيناز deoxycytidine، مخلقة folylpolyglutamate، أو البروتينات المقاومة للأدوية المتعددة) 6،8. ومع ذلك، تحليلا شاملا لمحات الربط من خلايا مقاومة للأدوية غير متوفرة بشكل مؤلم. لذلك، لا بد من تطوير أساليب إنتاجية عالية للتحليل الربط البديلة. هذا يمكن أن يساعد في تطوير أساليب علاجية أكثر فعالية.
خلال العقد الماضي، والتطور السريع لتقنيات الجيل القادم التسلسل (خ ع) قد أثرت البحوث الطبية الحيوية مع رؤى جديدة في الآليات الجزيئية التي تحكم تنظيم التعبير الجينوم ودورها في مختلف العمليات البيولوجية 9. RNA التسلسل (RNA وما يليها) يعد مصدرا قويا لتطبيق الفرعيةمن خ ع في مجال transcriptomics. لأنها تتيح التنميط على نطاق الجينوم (كما ونوعا) من أنماط التعبير الآلاف من الجينات في وقت واحد ومناسب تماما لتوصيف من mRNAs الترميز جديدة وطويلة الحمض النووي الريبي غير الترميز، ميرنا، سيرنا، وغيرها من الحمض النووي الريبي الصغيرة فصول (على سبيل المثال، snRNA وبيرنا) 10،11.
RNA تسلسل لديه العديد من المزايا أكثر من التقنيات السابقة لتوصيف Transcriptome على (على سبيل المثال، سانجر تسلسل وميكروأرس التعبير). وهو لا يقوم على الشرح الجينوم الحاليين، أن لديها مستوى النووية المنفردة القرار ولها مجموعة ديناميكية أوسع لتقدير مستوى التعبير. لفترة وجيزة، وسير العمل التجريبي الأساسي من التجارب الحمض النووي الريبي وما يليها يتكون من نص مذيل بعديد الأدينيلات (مرنا) اختيار والتشرذم، تليها تحويلها إلى كدنا]، بناء مكتبة وأخيرا، وبالتوازي مع نطاق واسع تسلسل عميق 12،13. بسبب الانخفاض السريع للsequencinتكاليف ز على مدى السنوات القليلة الماضية، RNA وما يليها وتحل تدريجيا محل غيرها من التقنيات، وتبذل جهودا كبيرة لتحسين بروتوكولات إعداد المكتبة. على سبيل المثال، فمن الممكن الآن الاحتفاظ بالمعلومات حبلا من النصوص مرنا عن طريق وضع علامة على كدنا] الشق الثاني مع ثلاثي deoxyuridine (dUTP)، وقبل PCR التضخيم، وهضم حبلا ملحوظ مع اليوراسيل-DNA-glycosilase (UDG). هذه العملية تعزز دقة الشرح الجينات وتقدير مستويات التعبير 14،15.
تحليل وتفسير البيانات RNA وما يليها تتطلب حزم البرامج الحسابية المعقدة وقوية ومعالجة داخل أنابيب بيوينفورمتيك 16،17. أولا، الخام يقرأ الخضوع لمراقبة الجودة عن طريق إزالة التحف الفنية والبيولوجية ونبذ (تقليم) تسلسل التي لا تصل متطلبات الجودة الصارمة. بعد ذلك يقرأ في كل عينة يتم تعيينها إلى الجينوم إشارة وفهرستهافي المستوى الجيني، على مستوى اكسون، أو على مستوى النص، من أجل تحديد وفرة من كل فئة. اعتمادا على التطبيق، ثم يتم احتساب البيانات المكررة من خلال النماذج الإحصائية لتحديد التعبير عن أليل معين، الربط البديلة، اندماج الجينات والنوكليوتيدات المفردة (النيوكلوتايد) (12). وأخيرا، التحليل التفاضلي على مستوى مختارة (أي التعبير الجيني أو الربط البديلة) يمكن استخدامها لمقارنة العينات التي تم الحصول عليها تحت ظروف مختلفة.
يصف تحليل الربط التفاضلية الاختلافات في استخدام الموقع وصلة بين اثنين من العينات. يتوفر عدد متزايد من حزم البرمجيات المخصصة لهذا الغرض على أساس النماذج الإحصائية المختلفة والعروض واجهة المستخدم (18). ومن بين هذه، والفرش (تحليل متعدد المتغيرات من نسخة الربط) تبرز بوصفها أداة الحسابية المتاحة بحرية ودقيقة تستند إلى إطار إحصائي النظرية الافتراضية ومصممة للكشف عن زراعية مختلفةأحداث الربط rential من أي بيانات الحمض النووي الريبي وما يليها نهاية واحدة أو المقترنة. بدءا من ملفات الانحياز (.bam)، يمكن الحصير كشف جميع أنواع رئيسية من الأحداث بديلة الربط (اكسون الطفر، بديلا 3 "لصق موقع بديل لل5" لصق موقع، الإكسونات يستبعد بعضها بعضا والاحتفاظ إنترون – أيضا انظر الشكل 1).
أولا، يحدد البرنامج يقرأ التي تدعم الحدث لصق معين، على سبيل المثال تخطي اكسون، وتصنفها إلى نوعين. "إدراج ما يلي:" (لهذا الحدث الكنسي لصق) الخريطة داخل اكسون التحقيق وتمتد تقاطعات بين أن اكسون محددة واثنين من الإكسونات المرافقة المنبع والمصب. "الطفر يقرأ" (لهذا الحدث لصق البديل) تمتد من تقاطع بين البلدين المرافقة الإكسونات. وفي وقت لاحق، والفرش إرجاع مستوى إدراج تطبيع للاحداث الكنسي والبديلة ويقارن القيم بين العينات أو شروط. في نهاية المطاف، فإنه يحسب ف قيمة الثانية معدل اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت) على افتراض أن الفرق في نسبة البديل من الجينات بين شرطين يتجاوز عتبة المعرفة من قبل مستخدم معين لكل حدث الربط 19،34.
بعد تحليل الربط التفاضلية بالتزامن مع الحمض النووي الريبي بعدها، له ما يبرره على التحقق التجريبي واسعة النطاق من أجل تحديد المرشحين الجينات إيجابي صحيح (18). الكمي عكس كتب-البلمرة المتسلسل (QRT-PCR) هو الأسلوب الأكثر استخداما والأمثل في المصادقة على المرشحين الحصول عليها من تحليل الحمض النووي الريبي يليها 20. والهدف من هذه الورقة هو تقديم منهجية قوية لتحقيق المخدرات المتعلقة المقاومة ملامح الربط في الأورام الصلبة والأورام الخبيثة الدموية. نهجنا يستخدم الحمض النووي الريبي وما يليها على أساس Transcriptome على التنميط من نماذج خط الخلية المحددة من المخدرات السرطانات المقاومة في تركيبة مع طريقة QRT-PCR للتحقق من صحة الجينات المرشحة المتورطين في مقاومة المخدرات المعمول بها.
<p clasالصورة = "jove_content"> وتضمنت نماذج خط خلية سرطان الدم البشري المستخدم في هذه الدراسة للأطفال تي خلية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL) خط الخلية مدونة السلوك-CEM (CEM-WT)، وهما الاستيرويد (GC) المقاوم subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) وCEM-C7R5 (CEM-R5) 21،22 والميثوتريكسيت (MTX) المقاوم subline CEM / R30dm 23. على الرغم من أن العلاجات الحالية القائمة على GCS وMTX تضع فائدة سريرية في حوالي 90٪ من الحالات، وظهور GC-المقاومة لا يزال يمثل مشكلة لم تحل بعد مع الآلية الجزيئية غير واضحة. لعزل الحيوانات المستنسخة دون مقاومة للGC، كانت خلايا CEM-WT مثقف في 1 ميكرومتر ديكساميثازون (ديكس) لمدة 2 إلى 3 أسابيع. وقد وضعت subline مقاومة للMTX CEM / R30dm خلال المدى القصير المتكررة (24 ساعة) تعرض خلايا CEM-WT إلى 30 ميكرومتر MTX بمثابة تقليد من البروتوكولات السريرية. ومن المثير للاهتمام، عرض هذا الخط الخلية أيضا عبر المقاومة إلى التنفيذ المباشر (نتائج غير منشورة) التي لم يتم فهم الآلية بشكل كامل.وتوم الصلبةأو نموذج التحقيق في هذه الدراسة هو غدية الأقنية البنكرياس، تشتهر حران الاستثنائي للعلاج الكيميائي. تحقيقا لهذه الغاية، اخترنا خط Panc-1 الخلية ولها مقاومة للجيمسيتابين دون استنساخ Panc-1R التي حصلت عليها الحضانة مستمرة مع 1 ميكرومتر من المخدرات (24). نحن هنا وصف نهج لاكتشاف آليات جديدة الكامنة في المختبر مقاومة المخدرات عن طريق الجمع بين ثلاثة بروتوكولات: فحوصات السمية الخلوية اللونية لتقييم حساسية المخدرات في خلايا اللوكيميا والخلايا السرطانية من الأورام الصلبة، خط أنابيب الحمض النووي الريبي استنادا وما يليها إلى تحديد المتغيرات لصق جديدة تتعلق حساسية العقاقير / المقاومة وRT-PCR وتحليل QRT-PCR للتحقق من صحة المرشحين المحتملين.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف نهجا جديدا يجمع بين تقنيات فحص السمية الخلوية راسخة وقوية transcriptomic أساس خ ع و تحليلات لتحديد الأحداث الربط التفاضلية فيما يتعلق المقاومة للأدوية. المقايسات طيفية وطرق الإنتاجية العالية مريحة وقوية لتقييم حساسية المخدرات في المختبر في نماذج السرطان ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).
Materials
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
References
- Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
- McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
- Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
- Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
- Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
- Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
- Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
- Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
- Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
- Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
- Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
- Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
- Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
- Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
- Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
- Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
- Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
- McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
- Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
- Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
- Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
- Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
- Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
- Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
- Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
- Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
- Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).
